论文部分内容阅读
胚胎期，鸡的肝脏是其物质能量代谢最活跃的组织器官，并且肝脏是唯一一个所有能量代谢通路和代谢酶都有活性的器官[1]。在鸡胚孵化的最后一周，肝脏的脂代谢非常活跃，比如运输储存从头合成的甘油三酯和胆固醇，以及包裹形成极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白。此时，鸡的肝脏糖异生具有重要的作用，因为此时的鸡胚肌肉生长迅速，且肌肉内糖原的存储也显著加强，而鸡胚的肝脏糖异生是其葡萄糖的唯一来源。不同品种的鸡，在生长和代谢等方面的表现都有很大的不同，但对于不同品种鸡胚胎期肝脏的能量代谢报道的不是很多。 近年，与肥胖相关的基因FTO被发现与能量代谢有很大的相关性，但研究几乎集中在哺乳动物和人，禽类上的研究鲜有报道，且直接FTO功能的报道很少，因此本文将品种比较、相关性分析和细胞转染两个方面研究鸡FTO的功能。 1.鸡胚肝脏糖脂代谢相关基因和FTO表达的品种差异 选取快速生长型的白羽罗氏肉鸡和慢速生长型的广州温氏黄羽肉鸡种蛋，在标准条件下孵化，于18胚龄时采样。快速生长型肉鸡的种蛋和18胚龄时的胚重均显著高于慢速生长型肉鸡的(P＜0.05)，18胚龄时血清和肝脏中的甘油三酯(Triglycerol，TG)含量均是快速生长型肉鸡的显著高(P＜0.05);血清中总胆固醇(Totalcholesterol，Tch)、高密度脂蛋白胆固醇（Highdensitylipoproteincholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（Lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-C）的含量均是快速生长型肉鸡的显著低于慢速生长型肉鸡的(P＜0.05)，而肝脏中Tch的含量无品种差异;血清中葡萄糖（glucose）和乳酸(Lacticacid，LD)的含量是快速生长型肉鸡的显著高(P＜0.05);脂代谢相关基因的表达，脂肪合成的酶如脂肪酸合酶(Fattyacidsynthase，FAS)、乙酰辅酶A羧化酶（AcetylCoAcarboxylase，ACC）和苹果酸酶(Malicenzyme，ME)以及固醇类调控元件结合蛋白1(Sterolregulatorelementbindingprotein1，SREBP-1)的基因表达在品种间无显著差异，但脂肪分解酶肉碱棕榈酰转移酶（Carnitinepalmitoyltransferase，CPT1）的基因表达是快速生长型肉鸡的显著高于慢速生长型肉鸡的(P＜0.05);载脂蛋白B(ApolipoproteinB，ApoB)的基因表达则是快速生长型肉鸡的显著低(P＜0.05);固醇类调控元件结合蛋白2(Sterolregulatorelementbindingprotein2，SREBP-2)和胆固醇分解的酶胆固醇-7α-羟化酶(Cholesterol-7alpha-hydroxylase，CYP7A1)的基因表达均表现为快速生长型肉鸡的显著低于慢速生长型肉鸡的（P＜0.05）;同时，18胚龄时，快速生长型肉鸡肝脏中胞浆型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Cytosolicformphosphoenolpyruvatecarboxykinase，PEPCK-c)和果糖-1，6-二磷酸酶(Fructose-1，6-bisphosphatase，FPB1)的基因表达均显著高于慢速生长型肉鸡的(P＜0.05)，但脂肪和肥胖相关基因FTO(fatmassandobesityassociatedgene，FTO)的基因和蛋白表达却在两品种间无显著差异;进一步的相关性分析也没有发现FTO的表达与糖脂代谢的相关基因表达间有显著的相关性。结果提示，18胚龄时，快速生长型内鸡肝脏脂代谢和糖异生均较慢速生长型肉鸡的活跃，而FTO的表达似乎与此没有显著的相关性。 2.鸡胚肝脏糖异生品种差异的分子机制研究 我们之前的实验发现，18胚龄时，快速生长型肉鸡肝脏糖异生关键酶PEPCK-c的基因表达强于慢速生长型肉鸡，但其表达的品种差异的具体机制尚不清楚，即为本部分的研究目的和内容。实验首先预测了鸡PEPCK-c基因启动子上的CpG岛和转录因子结合位点，接着发现转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMPresponseelementbindingprotein，CREB1)的基因表达以及磷酸化的CREB1(pCREB1)的蛋白表达均为快速生长型肉鸡的显著高(P＜0.05);ChIP的结果显示，快速生长型肉鸡肝脏PEPCK-c基因启动子上结合有较多的pCREB1（P=0.08）;而IP-IB的结果并未发现FTO可以和pCREB1结合;PEPCK-c基因启动子的表遗传修饰在两个品种间亦表现有差异，即快速生长型肉鸡PEPCK-c基因CpG岛的甲基化水平和组蛋白H3水平较低（P＜0.05），而组蛋白H3的乙酰化（HistoneH3acetylation，H3ac）和组蛋白H3赖氨酸27三甲基化（TrimethylatedhistoneH3lysine27，H3K27me3）水平显著地高(P＜0.05)。结果提示，18胚龄时，肉鸡肝脏PEPCK-c表达的品种差异可能主要是由转录因子pCPEB1的调节引起的，而FTO尚未发现参与其中。 3.FTO基因的超表达和RNA干扰对鸡胚成纤维细胞DF-1的影响 有大量文献报道，FTO与能量代谢相关，但研究集中在哺乳动物和人。而对于禽类，FTO有怎样的生物学功能尚待研究。所以，本章选用鸡胚成纤维细胞DF-1细胞系，并构建鸡的FTO超表达质粒(F+)和干扰质粒(F-)进行转染，观察对DF-1细胞的影响。结果显示，转染24小时，FTO并不会对DF-1细胞的细胞活力造成影响;转染后，F+组的FTO基因和蛋白表达均显著高于对照组(P＜0.05)，F-组的表达则显著低于对照组(P＜0.05);F+组的糖皮质激素受体(Glucocorticoidreceptor，GR)、葡萄糖-6磷酸酶（Glucose-6-phosphatase，G6PC）和线粒体型的PEPCK(PEPCK-m)的基因表达均显著高于对照组(P＜0.05)，而F-组这三个基因的表达则显著低于对照组(P＜0.05);而与脂代谢、胆固醇代谢、胰岛素通路、线粒体功能、氧化应激等相关的基因表达则无显著的变化。以上结果提示，FTO可能主要是影响DF-1细胞的糖异生功能。 4.FTO基因的超表达和RNA干扰影响DF-1细胞糖异生的机制研究 我们之前的实验发现FTO对DF-1细胞的糖异生的几个关键酶有影响，但机制如何尚不明了。本章同样采取FTO超表达(F+)和干扰质粒(F-)对DF-1细胞进行转染，发现转染24小时，F+组细胞上清中的葡萄糖含量显著低于对照组(P＜0.05)，乳酸含量则显著高于对照组(P＜0.05)，F-组的这两个指标则与对照组无显著差异;DF-1细胞中糖原含量表现为F+组显著高于F-组(P＜0.05)，但F+组和F-组与对照组均无显著差异;F+组G6PC的蛋白表达和酶活均显著高于对照组(P＜0.05)，而F-组与对照组无差异。G6PC基因启动子上的转录因子C/EBP-beta和CREB1的基因表达均为F+组的显著高于对照组(P＜0.05)，而这两个转录因子只有C/EBP-beta的基因表达在F-组中均显著下调(P＜0.05);C/EBP-bcta和CREB1的蛋白表达在F+组显著高于对照组（P＜0.05），而这两个蛋白在F-组均无显著变化;ChIP实验发现，G6PC基因启动子上转录因子C/EBP-beta和pCREB1的结合在F+组显著高于对照组(P＜0.05)，F-组pCREB1的结合显著降低(P＜0.05)，而C/EBP-beta则无显著变化;IP-IB结果显示，F+组FTO结合了较多的C/EBP-beta蛋白，同时C/EBP-bcta也结合了较多的FTO蛋白（P＜0.05），即增强了二者的互作效应。以上结果提示，FTO可能是通过与C/EBP-beta以蛋白-蛋白互作的形式共同作用于G6PC的启动子上，来促进G6PC的表达，进而促进DF-1细胞的糖异生。