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兔支气管败血波氏杆菌(Bordetella Bronchiseptica,Bb)是引起家兔慢性呼吸道疾病的主要病原,其致病病程长,难治愈,是严重影响兔产业的重要疾病,临床上有该菌感染人的报道。目前,该病的疫苗还处于实验室研究阶段、保护率较低,开展高效的支气管败血波氏杆菌疫苗研究佐剂,提高疫苗对兔机体的保护效果,对改善兔产业体系健康发展及公共卫生安全具有重要意义。本研究对不同的佐剂进行了筛选,对筛选出的新型佐剂苗木鳖子提取物(Extract of cochinchina momordica seeds,ECMS)+ 油佐剂苗与常规油佐剂苗及无佐剂苗进行了比较研究,对新型佐剂进行了免疫增强作用的研究,新型佐剂苗不仅提高动物机体的体液免疫而且提高了其细胞免疫水平。本研究为兔波氏杆菌疫苗的研发提供了技术依据,同时也为兽用新型疫苗的开发提供了新的思路。1.兔支气管败血波氏杆菌间接ELISA检测方法的优化以兔Bb全菌蛋白包被酶标板,建立了Bb间接ELISA检测方法。优化的结果为:全菌蛋白(1 μg/ml)37 ℃包被2h;封闭液为5%的脱脂乳,37℃作用2h;血清以1:400稀释后37℃作用1h;二抗(1:5000)37℃作用75 min;显色条件为37℃避光作用10 min。阴阳性临界值为0.19。该方法以其高敏感性、稳定性以及高度的特异性,为波氏杆菌的抗体检测提供了可靠的技术手段。2.兔支气管败血波氏杆菌病灭活苗佐剂的筛选本研究在波氏杆菌灭活苗中添加了不同剂量的ECMS,不同剂量ECMS+油,以及常规的矿物油和铝胶佐剂,以上疫苗免疫家兔后不同时间采集血清,以不同蛋白作为包被抗原检测血清抗体IgG,同时检测血清中IL-2的含量等,攻毒前采集全血,MTT试验检测家兔的细胞免疫状态,最后进行攻毒感染检测疫苗保护率。结果显示ECMS800+油组的抗全菌蛋白和外膜孔蛋白前体(outer membrance porin protein precursor,PPP)抗体水平均不同程度高于其他各组,细胞因子IL-2的含量较其他各组均有上升的趋势(P<0.05),ECMS800+油组的淋巴细胞刺激指数在三种刺激物的刺激下均高于其他各组,两次的攻毒保护率均最高,分别为78%和100%。综上所述,比较筛选出ECMS800+油为最优佐剂。3.ECMS800+oil对兔支气管败血波氏杆菌灭活苗免疫增强作用的研究本试验用油佐剂苗及无佐剂苗作为对照,对筛选的ECMS800+油苗进行免疫指标检测,对其免疫增强作用进行了初步探究。家兔免疫后,间接ELISA检测血清中IgG抗体水平、可溶性CD4(sCD4)及CD8分子(sCD8)含量以及器官粘膜中IgA抗体水平;采集抗凝血MTT法检测淋巴细胞转化率、试剂盒检测淋巴细胞上清中细胞因子IL-2、IFN-γ的表达量、流式细胞法检测CD4+、CD8+型T细胞含量;无菌摘取脾脏荧光定量检测脾脏中IL-2、IL-6、IFN-y等的表达量;气管粘膜及肺脏做石蜡切片检测IgA阳性细胞的含量;称取免疫兔脾脏和胸腺鲜重及活体重检测免疫器官指数;最后进行攻毒感染试验。结果ECMS800+油苗有效提高了家兔的体液免疫和细胞免疫水平,并达到了较好的粘膜免疫效果,疫苗保护率得到了明显的提高,激发了机体全面而持久的免疫反应。该佐剂的研究为波氏杆菌疫苗的研发提供了新方法。