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本实验室从土壤中分离的枯草芽孢杆菌JM4(Bacillus subtilis JM4)产生两种新型抗菌肽。本论文对此两种抗菌肽的分离、纯化及生物合成等方面进行了较为深入的研究。
一、产生菌的菌种鉴定及所产生抗菌物质的分离、纯化和性质研究：首先，对该菌株进行生理、生化性质测定及16S rDNA序列分析，结果表明与枯草芽孢杆菌非常相近，该菌株被命名为Bacillus subtilis JM4。随后，采用硫酸铵沉淀、SP-Sepharose Fast Flow、Sephadex G-25和C18 RP-HPLC等手段从其发酵液中分离纯化出两种抗菌肽：Subpeptin JM4-A和Subpeptin JM4-B。此两种抗菌肽抑菌谱较广，对某些革兰氏阳性菌，如乳杆菌、葡萄球菌和棒状杆菌具有较强的抑制作用，对部分革兰氏阴性菌，如沙门氏菌和福氏志贺氏菌也具有一定的抑制作用；且对热高度稳定，20℃～100℃加热30 min活性不变，仅在高pH条件下(pH≥10)活性才开始稍有下降。质谱测定表明这两种抗菌肽的分子量分别为1422.71 Da和1422.65 Da；Edman降解法序列测定表明，Subpeptin JM4-A的氨基酸序列为：X-X-K-E-I-X-W-I-F-H-D-N，Subpeptin JM4-B的氨基酸序列为：X-X-K-E-I-X-H-I-F-H-D-N。蛋白数据库同源性比较揭示，此两种物质与己报道的抗菌肽无明显同源性，为两种新型抗菌肽。
二、抗菌肽Subpeptins生物合成方式的研究：为验证抗菌肽Subpeptin JM4-A和Subpeptin JM4-B是否与非核糖体肽合成酶有关，根据非核糖体肽合成酶的高度保守序列设计—对兼并性引物TGD和LGG，以Bacillus subtilis JM4总DNA为模板进行PCR扩增。扩增产物PCR12与非核糖体肽合成酶的编码序列具有较高同源性，以此序列为基础，运用嵌套式PCR克隆了约4 kb的DNA片段(PCR40)，通过同源重组对Bacillus subtilis JM4进行了基因破坏，抑菌活性检测表明基因破坏株的抑菌活性大大降低，且RP-HPLC分析表明基因破坏株发酵液中与野生型菌株发酵液中相对应的活性峰消失，证明此4 kb片段与Subpeptins的生物合成有关。以上结果表明，抗菌肽Subpeptin JM4-A和Subpeptin JM4-B的生物合成与非核糖体肽合成酶密切相关。
三、抗菌肽Subpeptins生物合成基因簇的克隆及相关基因的功能分析：基于PCR40序列，运用嵌套式PCR方法共克隆了约48 kb大小的Subpeptins生物合成基因簇，序列分析表明此生物合成基因簇含有9个编码区，依次为subT、subA、subB、subC、subR、subS、subE、subF和subG。其中，subT的编码产物含有与硫酯酶相关的结构域；subA、subB和subC的编码产物具有非核糖体肽合成酶的典型特征，分别由5个、2个和5个模块构成；subR和subS的编码产物含有双组分调控系统的保守结构域；subE和subG的编码产物分别含有与ABC转运蛋白和酸性磷酸酶相关的保守结构域。为进一步验证所克隆的基因簇确实与抗菌肽Subpeptin JM4-A和Subpeptin JM4-B生物合成相关，通过同源重组对其中两个较大的编码区subA和subC进行基因破坏，相应基因破坏株的生物活性检测和HPLC分析表明，subA和subC基因的确参与了抗菌肽Subpeptin JM4-A和Subpeptin JM4-B的生物合成。