目的:视神经损伤后存活视网膜节细胞数量明显减少,胶质瘢痕形成及胶质细胞释放的抑制再生的各种分子,阻碍了再生轴突通过损伤区域,神经再生困难。从组织工程的角度,我们将羊膜上皮细胞接种于胶原海绵上,体外构建羊膜上皮细胞/胶原海绵复合体,移植入大鼠视神经受损部位,初步观察和探讨复合体对损伤后视神经修复的作用及相关机制。方法:(1)取妊娠晚期SD大鼠的羊膜组织,贯序消化后进行羊膜上皮细胞原代培养,传代细胞进行免疫荧光细胞化学和定量PCR鉴定。(2)将传代羊膜上皮细胞接种于胶原海绵上,体外共培养1周,行免疫荧光细胞化学、定量PCR鉴定。(3)用荧光染料标记细胞、扫描电镜、HE染色、CCK-8法等方法,检测复合体上羊膜上皮细胞生长及增殖情况。(4)将构建的羊膜上皮细胞/胶原海绵复合体移植入成年雄性SD大鼠视神经切断伤模型中,设以下4组:正常对照组;损伤组,于眼球后约2 mm处用1ml注射器针尖将神经外膜纵向切开,完全切除一段长约0.5 mm的神经,致视神经完全断开,但保持视神经外膜和血管完整,于视神经缺损处注入10μl无血清培养基;空支架组是在损伤组的基础上,于视神经缺损处植入预培养1周的胶原海绵;实验组是在损伤组的基础上,于视神经缺损处移植入羊膜上皮细胞/胶原海绵复合体并注入10μl羊膜上皮细胞悬液(5×10~6个/ml)。(5)在部分羊膜上皮细胞/胶原海绵复合体移植组,用CM-Dil标记支架上细胞的细胞膜,术后4周、8周经心灌注固定,取视神经作冰冻切片,观察标记细胞的存活和分布。(6)部分动物取材前48 h,玻璃体注射CTB标记视网膜节细胞,术后4周经心灌注固定,取眼球视网膜铺片,计数CTB标记细胞;部分动物术后4周经心灌注固定,取眼球视网膜铺片,尼氏染色计数视网膜节细胞;部分动物术后4周、8周取视神经眶内段HE染色观察组织结构和细胞密度变化,免疫组织化学染色法显示GAP-43表达。结果: (1)体外成功培养获得大鼠羊膜上皮细胞,接种于胶原海绵,免疫荧光细胞化学染色鉴定后显示,接种胶原海绵前后,羊膜上皮细胞均能表达上皮细胞特异性标志物CK-19、神经干细胞标志物Nestin、以及细胞多能性标志分子Oct-4、Nanog等。(2)定量PCR检测,结果显示羊膜上皮细胞接种胶原海绵前后均有CK-19、Nestin、Oct-4、Nanog、bFGF的mRNA表达,且细胞接种胶原海绵后Nestin的mRNA表达显著上调。(3)经荧光标记、扫描电镜、HE染色、CKK-8法检测,结果显示羊膜上皮细胞能较好地粘附于胶原海绵上生长,胶原海绵能促进羊膜上皮细胞增殖。(4)将用CM-Dil标记细胞的复合体移植入大鼠视神经切断伤模型后,术后4周、8周取视神经行冰冻切片,可观察到损伤区有标记的细胞存活,能向受损视神经近侧段和远侧段迁移,并可沿神经外膜向两侧迁移。(5)损伤后4周,CTB及尼氏染色视网膜节细胞的计数结果显示,各组节细胞密度较正常组明显降低,细胞复合体组节细胞密度较损伤组、空支架组增加;空支架组的节细胞密度较损伤组无明显差异。(6)HE染色视神经显示,胶原海绵移植体内后,能与断端神经组织相融合,术后8周基本降解。视神经损伤区有大量细胞存在,呈不规则条索状分布并向两端延伸。视神经损伤后远侧段细胞核明显变小,而复合体移植组的胞核与正常对照组大小相似。伤后4周、8周计数远侧段细胞结果显示,各组细胞数量均高于正常组,空支架组较损伤组细胞数量无增加,细胞复合体组细胞数量增加明显高于损伤组及空支架组。(7)免疫组织化学法对视神经GAP-43染色后显示,损伤组、空支架组中GAP-43在损伤区仅有少量表达,远侧段未见表达;复合体移植后损伤区GAP-43表达明显增多,可见少量GAP-43阳性、类似再生轴突样结构,由伤区伸入至远侧段,8周时能较4周达到更远处。结论:(1)羊膜上皮细胞与胶原海绵组织相容性好,胶原海绵能促进羊膜上皮细胞的增殖,促进羊膜上皮细胞向神经干细胞方向分化,复合体活性较好;(2)复合体移植受损视神经后,部分复合体细胞能在损伤部位存活至少8周并向损伤区两侧迁移,能在一定程度上保护视网膜节细胞和视神经的神经胶质细胞,增强视神经再生轴突的生长活力,特别是能促使少量再生轴突通过损伤部位进入到远侧段神经,表明所构建的复合体能改善视神经再生微环境、促进轴突再生。