目前,宫颈癌是仅次于乳腺癌的最常见的妇科恶性肿瘤,全世界每年新发病例近50万人,死亡约23余万人,严重威胁着妇女生命健康。发展中国家宫颈癌的每年新发病例及死亡病例均远高于发达国家,其中我国就是宫颈癌高发地区之一。尽管HPV的持续感染是已知的导致宫颈癌的主要原因,许多国家开展大规模HPV疫苗接种来积极预防宫颈癌的发生；宫颈上皮细胞学检查及HPV联合检测被较普遍应用于有性生活妇女的宫颈癌筛查中,以助于疾病的早发现、早治疗,但是我国宫颈癌的发病率及死亡率依然维持在较高水平,目前尚没有一个完美的治疗宫颈癌的方法,宫颈癌仍然是主要的公共健康问题。因此,进一步研究宫颈癌的进展机制,探讨其可能的新的治疗方向是十分必要的。肿瘤的发生发展与其所处内外环境密切相关,肿瘤细胞与其周围环境的持续相互作用促进了肿瘤的发生发展与转移。关于肿瘤与其所处环境的研究主要集中在以下几种间质成分,如：内皮细胞、炎症细胞、免疫因子等。然而除免疫分子、炎症细胞等外,基本组织结构也是肿瘤所处内外环境的重要组成部分。目前关于肿瘤中基本组织结构的研究,国内外研究主要集中在血管、淋巴管方面,研究证实肿瘤中血管的生成与肿瘤的发病机制密切相关,并对肿瘤的发生发展起着重要作用。这一观点已被国内外学者普遍接受,同时进一步引起了人们对肿瘤中基本组织结构的关注。在人体内,从解剖学角度看,神经常与血管及淋巴管组织相伴行。尽管肿瘤的嗜神经性(神经浸润)发生胰腺癌、胃癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中已经得到广大学者的认同,然而传统观点认为肿瘤组织中并不存在神经纤维。直到进入21世纪以来,国外研究者利用电镜发现在膀胱癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中存在神经纤维的分布。此后,陆续有研究在前列腺癌、结肠癌、胃癌等恶性肿瘤中发现神经纤维的分布,也有研究表明肿瘤中可能存在神经新生。同时神经递质和神经营养因子与肿瘤生物学行为的关系也逐渐被人们所认识。综上所述,这些研究提示我们某些肿瘤组织中确实存在神经纤维,且可能对肿瘤的发生发展具有一定的相关性。然而,关于宫颈癌灶中的组织结构,国内外已有研究证实其内含有较丰富的血管及淋巴管,但是对于宫颈癌灶所处环境中神经纤维的研究,仅有少量的报道集中在宫颈癌的神经浸润方面,尚无研究证实宫颈癌灶中是否含有神经纤维及其与宫颈癌的相关性。因此我们有必要对宫颈癌灶的组织结构进行详细的定性研究,以全面了解组织成分,进一步探讨其中神经纤维的分布情况,以助于了解其与宫颈癌发病机制的相关性。我们的前期研究中对广泛性子宫切除术后子宫主韧带、骶韧带及阴道旁组织复合体分别进行了组织结构的定性定量研究,其中包括对神经的定性及定量对比研究,这为本研究提供了一定的实验经验及技术基础。本研究分为三部分进行,具体如下：第一部分：宫颈癌灶组织结构的精细定性研究本研究首先对宫颈癌灶中基本组织结构进行定性分析,包括固有结缔组织、脉管组织及神经纤维。[目的]研究宫颈癌灶的组织结构,了解宫颈癌灶的组织成分。[方法]选取2014年6-10月在南方医科大学南方医院行宫颈活检及广泛性子宫切除术后的新鲜宫颈癌灶标本33例,每块标本经10%福尔马林固定、常规石蜡包埋、切片后分别采用HE染色、特殊染色及多种免疫组织化学染色对宫颈癌灶进行定性研究。对神经纤维的研究中我们以神经特异性抗体s-100标记总神经,检测宫颈癌灶中是否存在神经纤维,进一步对神经纤维的性质和种类进行研究,分别以生长相关蛋白GAP-43抗体检测新生神经,以髓鞘特殊染色检测自主神经,并对自主神经进行交感及副交感神经(分别用酪氨酸羟化酶TH抗体、肠血管活性多肽VIP抗体标记)的检测分析。[结果]1宫颈癌灶中常见组织染色结果1.1 HE染色结果33例标本中均可见大量不同分化程度的癌细胞,大量的血管组织,包含细小动静脉及微血管。此外,癌间质中尚可见丰富纤维结缔组织,包绕癌巢。33例标本中未能清晰辨认淋巴管及神经纤维等组织结构。1.2固有结缔组织染色结果改良的Masson三色染色法显示33例癌灶中均含有丰富的染色为深绿色胶原纤维,胶原纤维围绕癌巢,分布在癌间质中。未见染色为鲜红色的平滑肌纤维。醛品红染色法显示33例癌灶中均含有染色为深紫色的弹力纤维,弹力纤维围绕癌巢,分布在癌间质中,其中大部分深紫色弹力纤维在动脉上显色。1.3血管染色结果特异性标记血管内皮细胞的CD-34抗体免疫组化染色显示33例标本癌间质中均含有丰富的染色为棕色的血管,部分血管管腔内可见癌细胞浸润。进一步用比醛品红染色法显示弹力纤维为深紫色的动脉。1.4淋巴管染色结果D2-40特异性标记淋巴管,见33例癌灶中均含有较多染色为棕色的淋巴管,其分布在癌间质中。部分淋巴管腔内可见癌细胞浸润。2神经纤维染色结果2.1总神经染色特异性标记神经的S-100抗体免疫组化染色显示宫颈癌灶中总神经染色阳性的有14例,阴性的有19例,总神经阳性率为42.42%(14/33)。神经纤维分布在癌间质中。2.2新生神经染色特异性标记新生神经的GAP-43抗体染色法显示宫颈癌灶中新生神经染色阳性的有11例,阳性率为33.33%(11/33)。新生神经分布在癌间质中,其所占神经阳性数比例为78.57%(11/14)。2.3自主神经染色变色酸2R亮绿法特异性染色法显示宫颈癌灶中神经髓鞘染色均为阴性。进一步用TH和VIP特异性抗体分标记交感神经和副交感神经,染色结果显示交感神经染色阳性有7例,副交感神经染色阳性有5例,其中交感及副交感神经均染色阳性有3例,两者阳性率分别为21.21%(7/33)、15.15%(5/33)。交感神经及副交感神经占S-100阳性数的比例分别是50%(7/14)、35.71%(5/14)。[结论]本研究发现,宫颈癌灶中除大量癌细胞外,尚有胶原纤维、弹力纤维、血管及淋巴管等常见组织结构,未见平滑肌纤维。此外还发现部分宫颈癌灶中存在神经纤维,且在神经的性质上,神经纤维以新生神经为主；在神经的种类上,均为无髓鞘神经,其中以自主神经为主,交感神经高于副交感神经。第二部分：宫颈癌灶、癌灶对侧宫颈组织及正常宫颈组织中神经纤维分布的对比研究[目的]比较宫颈癌灶、癌灶对侧宫颈组织及正常宫颈组织中神经纤维的分布情况,探讨宫颈癌灶中神经纤维的分布种类。[方法]收集南方医科大学南方医院行广泛性子宫切除术后的新鲜宫颈癌灶对侧宫颈组织标本11例,因“子宫肌瘤”、“子宫腺肌病”行全子宫切除术后新鲜宫颈标本21例,所有标本均经组织病理学检测为无癌及无癌前病变的宫颈组织。第一部分实验的33例宫颈癌灶标本也纳入本次研究,共收集65例标本。每块标本经固定、脱水、石蜡包埋、切片后分别采用特异性标记神经纤维的S-100抗体、标记新生神经的GAP-43抗体、标记交感神经的TH抗体及标记副交感神经的VIP抗体进行免疫组织化学染色。将完成染色的玻片置于显微镜系统进行图片拍摄并分析,分别记录宫颈癌灶、癌灶对侧宫颈组织及正常宫颈玻片中S.100.GAP-43、TH及VIP染色阳性的例数。应用SPSS13.0统计软件进行分析,以P<0.05认为差异具有统计学意义。三组间神经纤维阳性率的比较采用R×C表资料的卡方检验进行统计分析。[结果]1、三组间神经纤维的染色结果(1)三组间总神经的分布结果宫颈癌灶、癌灶对侧宫颈组织及正常宫颈组织间总神经阳性率分别为42.42%、72.73%、76.19%。三组间总神经分布具有显著差异(x2=7.135,P=0.028),其中宫颈癌灶中总神经的阳性率低于癌灶对侧宫颈组织及正常宫颈组织。(2)三组间新生神经的分布结果宫颈癌灶、癌灶对侧宫颈组织及正常宫颈组织间新生神经阳性率分别为33.33%、9.09%、4.76%。三组间新生神经分布具有显著差异(x2=7.532,P=0.023),其中宫颈癌灶中新生神经的阳性率高于癌灶对侧宫颈组织及正常宫颈组织。(3)三组间自主神经的分布结果宫颈癌灶、癌灶对侧宫颈组织及正常宫颈组织间交感神经阳性率分别为21.21%、54.55%、66.67%,副交感神经阳性率分别为15.15%、18.18%、14.29%。(?) 三组间交感神经的分布具有显著差异(x2=11.841,P=0.003),其中宫颈癌灶中交感神经的阳性率低于癌灶对侧宫颈组织及正常宫颈组织。(?) 三组间副交感神经分布无明显差异(x2=0.087,P=0.957)。2、三组间新生神经及自主神经占总神经阳性的比例分布结果(1)三组间新生神经占总神经阳性的比例分布结果宫颈癌灶、癌灶对侧宫颈组织及正常宫颈组织三组间新生神经占其总神经阳性的比例分别为78.57%、12.5%、6.25%。三组间新生神经占其总神经阳性的比例分布具有显著差异(x2=19.474,P=0.000),其中宫颈癌灶中新生神经占总神经阳性的比例高于癌灶对侧宫颈组织及正常宫颈组织。(2)三组间自主神经占总神经阳性的比例分布结果(?) 三组间神经中自主神经均占大部分比例,其中交感神经均高于同组副交感神经。(?) 三组间交感神经占总神经阳性的比例分布无显著差异(x2=5.182,P=0.075)。(?) 三组间副交感神经占总神经阳性的比例分布无明显差异(x2=1.117,P=0.572)。[结论]宫颈癌灶中神经纤维的分布种类：(1)宫颈癌灶中总神经的阳性率低于癌灶对侧宫颈组织及正常宫颈组织,然而其中新生神经的阳性率明显高于其余两组,宫颈癌灶中神经纤维主要为新生神经；(2)宫颈癌灶中交感神经阳性率低于癌灶对侧宫颈组织及正常宫颈组织,副交感神经阳性率无明显差异,然而三组间均以自主神经为主,且交感及副交感神经分布的比例是相同的,交感神经均高于副交感神经。第三部分：宫颈癌灶中神经纤维与临床病理参数关系的研究[目的]探讨宫颈癌灶中神经纤维的分布与临床病理参数之间的关系。[方法]收集前期实验行宫颈活检术/广泛性子宫切除术后31例ⅠA期—ⅡA期宫颈癌灶标本,安徽省立医院行全子宫切除术/广泛性子宫切除术后ⅠA期—ⅡA期宫颈癌灶已包埋蜡块组织108例,共139例。所有蜡块组织经连续切片后分别用神经特异性抗体S-100、新生神经特异性抗体GAP-43、自主神经(交感神经特异性抗体TH、副交感神经特异性抗体VIP)进行免疫组织化学染色,将完成染色的玻片置于显微镜系统进行图片拍摄并分析。应用SPSS13.0统计软件进行分析,以P<0.05认为差异具有统计学意义。采用独立样本t检测分析宫颈癌灶中神经纤维与患者年龄之间的关系,采用R×C表资料的卡方检验分析宫颈癌灶中神经纤维与其余各临床病理参数之间的关系,采用二分类Logistic回归析宫颈癌灶中神经纤维与临床病理参数的相关关系。[结果]1、神经纤维染色结果139例宫颈癌标本中总神经染色阳性共有80例,阳性率为57.55%(80/139)；新生神经染色阳性共有48例,阳性率为34.53%(48/139)；自主神经中交感神经染色阳性共有46例,副交感神经染色阳性共有18例,其中交感及副交感神经均染色阳性有11例,交感神经阳性率为33.09%(46/139),副交感神经阳性率为12.95%(18/139)。2、宫颈癌灶中神经纤维的分布与临床病理参数的关系2.1宫颈癌灶中总神经的分布与临床病理参数的关系(?) 年龄与宫颈癌灶中总神经的分布具有显著差异(t=-2.713,P=0.008),其中总神经阳性颈癌灶组患者的平均年龄低于总神经阴性组。(?) 宫颈癌灶中总神经的分布与其病理类型具有显著相关性(x2=6.279,P=0.012),其中鳞癌的总神经分布阳性率明显高于腺癌。(?) 分期、分化程度、癌灶大体类型、癌灶大小及盆腔淋巴结转移均与宫颈癌灶中总神经的分布无明显差异,其P值分别为0.452、0.798、0.810、0.640、0.681。(?) 二分类Logistic回归分析结果表明年龄与病理类型对宫颈癌灶的总神经分布具有相关性,其中年龄为保护因素,年龄越大,宫颈癌灶中总神经的阳性率越低(B=-0.64,P=0.033)；病理类型为保护因素,宫颈腺癌中总神经阳性率低于鳞癌(B=-1.571,P=0.013)；而分期、分化程度、癌灶大体类型、癌灶大小及盆腔淋巴结转移均对宫颈癌灶的总神经分布无显著相关性。2.2宫颈癌灶中新生神经的分布与临床病理参数的关系(?) 宫颈癌灶中新生神经的分布与患者的年龄无明显差异(t=0.588,P=0.558)。(?) 宫颈癌灶中新生神经的分布与其分期、分化程度、病理类型、癌灶大体类型、癌灶大小及盆腔淋巴结转移无显著相关性,其P值分别为0.163、0.673、0.308、0.565、0.771、0.539。(?) 二分类Logistic回归分析结果表明分期对宫颈癌灶中新生神经的分布具有相关性,且分期为危险因素,分期越高宫颈癌灶中新生神经阳性率越高(B=0.686,P=0.005)；而年龄、分化程度、病理类型、癌灶大体类型、癌灶大小及盆腔淋巴结转移均对宫颈癌灶的新生神经分布无显著相关性。2.3宫颈癌灶中自主神经的分布与临床病理参数的关系2.3.1宫颈癌灶中交感神经的分布与临床病理参数的关系(?) 年龄与宫颈癌灶中交感神经的分布具有显著差异(t=2.432,P=0.016),其中交感神经阳性的宫颈癌灶组中患者平均年龄小于交感神经阴性组。(?) 宫颈癌灶中交感神经的分布与其病理类型具有显著相关性(x2=3.979,P=0.046),其中鳞癌的交感神经的阳性率明显高于腺癌。》宫颈癌灶中交感神经的分布与其分期、分化程度、癌灶大体类型、癌灶大小及盆腔淋巴结转移无显著相关性,其P值分别为0.229、0.972、0.548、0.709、0.837。(?) 二分类Logistic回归分析方结果表明分期对宫颈癌灶中交感神经的分布具有相关性,且分期为危险因素,分期越高宫颈癌灶中交感神经阳性率越高(B=0.606,P=0.014)；而年龄、分化程度、病理类型、癌灶大体类型、癌灶大小及盆腔淋巴结转移均对宫颈癌灶的交感神经分布无显著相关性。2.3.2宫颈癌灶中副交感神经的分布与临床病理参数的关系(?) 宫颈癌灶中副交感神经的分布与患者的年龄无明显差异(t=0.366,P=0.715)。(?) 宫颈癌灶中副交感神经的分布与其分期、分化程度、病理类型、癌灶大体类型、癌灶大小及盆腔淋巴结转移无显著相关性,其P值分别为0.081、0.681、0.354、0.631、0.258、0.538。(?) 二分类Logistic回归分析结果表明分期对宫颈癌灶中副交感神经的分布具有相关性,且分期为危险因素,分期越高宫颈癌灶中副交感神经阳性率越高(B=0.710,P=0.020)；而年龄、分化程度、病理类型、癌灶大体类型、癌灶大小及盆腔淋巴结转移均对宫颈癌灶的副交感神经分布无显著相关性。[结论]宫颈癌灶中神经纤维与临床病理参数的关系：(1)神经纤维在年轻宫颈癌患者中分布阳性率较高,以交感神经为主,而与副交感神经及新生神经不相关；(2)神经纤维在宫颈鳞癌中分布阳性率较高,且以交感神经为主,而与副交感神经及新生神经不相关;(3)临床分期分别是宫颈癌灶中新生神经、交感神经及副交感神经分布的影响因素,其中分期越高,其神经阳性率可能越高；(4)宫颈癌灶中神经纤维的分布与分化程度、癌灶大体类型、癌灶大小及盆腔淋巴结转移均无明显相关性。