【摘 要】
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目的 建立了一种灵敏度高、特异性好、精确、简便的逆转录-聚合酶链反应-微孔板酶联夹心杂交技术,对人IL-6mRNA进行定量检测.方法 用Primer Premier5.0软件设计IL-6引物及探
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目的 建立了一种灵敏度高、特异性好、精确、简便的逆转录-聚合酶链反应-微孔板酶联夹心杂交技术,对人IL-6mRNA进行定量检测.方法 用Primer Premier5.0软件设计IL-6引物及探针.上游引物和下游引物分别位于IL-6基因的第二、三外显子;捕获探针5’端用氨基修饰,可以与DNA结合微孔板表面的NOS基团共价结合,“竖直”地包被于微孔板内;检测探针5’端、3’端均用生物素修饰,可与亲和素标记的辣根过氧化物酶（Avidin-HRP）结合.抽取人外周静脉血,EDTA抗凝,用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取单个核细胞总RNA,将总RNA逆转录为cDNA,然后用IL-6引物进行热启动PCR扩增.扩增产物热变性后与检测探针一起加入已包被捕获探针的微孔板内进行夹心杂交,最后加入亲和素-辣根过氧化物酶及其底物,显色检测杂交信号.结论 该方法操作简便,灵敏度高,特异性强;精密度、线性良好,结果数据化,适合于细胞因子mRNA的半定量检测.
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