论文部分内容阅读
背景：面肩肱型肌营养不良（facioscapulohumeraldystrophy,FSHD）是一种常染色体显性遗传的神经肌肉疾病，国内报道的患病率约为1/20000。其发病率在肌营养不良中位列第三，仅次于Duchenne肌营养不良症（导致男性患儿迅速进展性肌无力）和强直性肌营养不良（引起男性和女性进行性肌肉无力和僵硬）。根据分子遗传突变特征可分为FSHD1和FSHD2两种类型。FSHD1（OMIM:158900）中位于染色体4q35上的大卫星重复序列D4Z4单元数减少为1-10引起D4Z4区染色质松弛而致病，正常人群参考范围为11-150，而FSHD2（OMIM:158901）中D4Z4重复单元数正常，但却存在染色体修饰因子基因突变导致D4Z4区染色质松弛而致病。1989年Lunt报道其外显率0-4岁少于5%，5-9岁为21%，10-14岁为58%，20岁及以后为95%。临床上这种疾病变异很大，可以在婴儿期即出现明显的肌营养不良症状，也可以到老年才开始出现症状，但是典型的是20岁左右出现症状，以选择性侵犯面肌、肩带肌和上臂肌群为特征，并可逐渐累及盆带肌、腹肌、足背屈肌，还可以侵犯眼外肌、呼吸肌甚至出现视网膜血管病变、听力下降、癫痫和智力发育迟滞等现象，病情进展缓慢，一般不影响寿命，但可对患者的生活质量造成损害。临床上有很多疾病临床表现与FSHD有交叉，故在进行面肩肱型肌营养不良患者病因调查与分子诊断时需筛查和鉴别诊断。目前筛查和分子诊断技术有染色体核型分析、多重连接探针扩增技术(multiplexLigation-dependentprobeamplification,MLPA)、Southernblotting印记技术、单分子荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)也称为分子梳技术（Molecularcombing,MC）、荧光定量PCR技术、荧光定量PCR毛细管电泳法即STR技术、单核苷酸多态性微阵列芯片(polymorphismarray,SNParray)、全外显子组测序技术（wholeexomesequencing,WES）和Bionano技术平台。其中单分子荧光原位杂交技术和Bionano技术平台中的单分子光谱技术（SingleMoleculeOpticalMapping,SMOM）对FSHD诊断正确性较高，故通过一系列调查和寻找分子病因时找到了一条诊断FSHD分子遗传学病因的高效技术，缩短了以往的检测时间，提高了效率，避免了以往检测技术的弊端，提高了检测的特异性、准确性和可重复性。
方法：先从2017年1月到2019年2月于我院遗传专家咨询门诊的家系数据库中筛选出有FSHD相关的肌营养不良表现的和或超声提示胎儿手、足、姿势异常病例，并收集对应家系临床资料，剔除非遗传因素，排除先天性代谢病、染色体核型异常、芯片检测异常、常见的DMD/BMD和SMA，所有患者和或家系成员进行相应遗传学检测。病因仍未明确的肌营养不良患者进行WES测序分析，从测序深度、覆盖度等方面综合分析全外显子组测序数据和质量；搜索NCBI、DGV、DECIPHER、UCSCGenome、gnomAD、OMIM、Pubmed、Polyphen-2等数据库从最小等位基因频率、蛋白质功能预测、临床表型、基因相关疾病等方面综合分析，筛选出疾病相关变异位点；参照“基因变异解读标准和指南”规则对变异位点致病性进行分类；用第一代Sanger测序法验证变异位点准确性及父母来源，最后对患者做出综合性分子遗传学诊断。层层调查后针对其中收录的病因未明的一个FSHD大家系主要选用单分子FISH技术和SMOM技术检测分析，明确家系各个成员分子病因。
结果：从535例家系数据库中筛选出65例FSHD相关的肌营养不良病例，运用MLPA技术、Sanger测序技术、STR技术发现12例DMD，运用MLPA、荧光定量PCR或Sanger测序技术发现10例SMA，根据临床表型、超声结果和就医检查记录排除非原发于肌肉的多系统疾病5例，运用SNPs芯片技术剔除2例芯片结果异常病例。针对余下病因仍未明确的36例家系，选取临床资料比较详细完整的8例家系进行分子测序检测分析，WES检测发现其中1例未检出致病性CNVs或致病性基因突变，2例多态性CNVs，4例检出有致病性基因突变，其中3例均是肌营养不良致病基因，分别是SGCA、TTN和LAMA2基因；余下一个未确诊的FSHD大家系进行单分子FISH检测和SMOM技术测序，发现FSHD家系患病成员主要病因为D4Z4重复数减少为4，符合FSHD诊断标准。
结论：FSHD临床异质性较高，表型多变且同家系内成员表现也有差异，故需结合多种分子检测技术进行筛查及分子诊断，明确类似表现的疾病分子病因，为遗传咨询和产前诊断提供理论依据；同时随着技术的不断发展和完善，单分子FISH技术越来越成熟的应用于FSHD常规分子诊断检测中，提早为患者找到明确病因，提供一个良好的预后；此外应用SMOM技术不仅能在分子水平诊断FSHD，而且可以成为寻找FSHD新的分子遗传学病因的高效工具。
方法：先从2017年1月到2019年2月于我院遗传专家咨询门诊的家系数据库中筛选出有FSHD相关的肌营养不良表现的和或超声提示胎儿手、足、姿势异常病例，并收集对应家系临床资料，剔除非遗传因素，排除先天性代谢病、染色体核型异常、芯片检测异常、常见的DMD/BMD和SMA，所有患者和或家系成员进行相应遗传学检测。病因仍未明确的肌营养不良患者进行WES测序分析，从测序深度、覆盖度等方面综合分析全外显子组测序数据和质量；搜索NCBI、DGV、DECIPHER、UCSCGenome、gnomAD、OMIM、Pubmed、Polyphen-2等数据库从最小等位基因频率、蛋白质功能预测、临床表型、基因相关疾病等方面综合分析，筛选出疾病相关变异位点；参照“基因变异解读标准和指南”规则对变异位点致病性进行分类；用第一代Sanger测序法验证变异位点准确性及父母来源，最后对患者做出综合性分子遗传学诊断。层层调查后针对其中收录的病因未明的一个FSHD大家系主要选用单分子FISH技术和SMOM技术检测分析，明确家系各个成员分子病因。
结果：从535例家系数据库中筛选出65例FSHD相关的肌营养不良病例，运用MLPA技术、Sanger测序技术、STR技术发现12例DMD，运用MLPA、荧光定量PCR或Sanger测序技术发现10例SMA，根据临床表型、超声结果和就医检查记录排除非原发于肌肉的多系统疾病5例，运用SNPs芯片技术剔除2例芯片结果异常病例。针对余下病因仍未明确的36例家系，选取临床资料比较详细完整的8例家系进行分子测序检测分析，WES检测发现其中1例未检出致病性CNVs或致病性基因突变，2例多态性CNVs，4例检出有致病性基因突变，其中3例均是肌营养不良致病基因，分别是SGCA、TTN和LAMA2基因；余下一个未确诊的FSHD大家系进行单分子FISH检测和SMOM技术测序，发现FSHD家系患病成员主要病因为D4Z4重复数减少为4，符合FSHD诊断标准。
结论：FSHD临床异质性较高，表型多变且同家系内成员表现也有差异，故需结合多种分子检测技术进行筛查及分子诊断，明确类似表现的疾病分子病因，为遗传咨询和产前诊断提供理论依据；同时随着技术的不断发展和完善，单分子FISH技术越来越成熟的应用于FSHD常规分子诊断检测中，提早为患者找到明确病因，提供一个良好的预后；此外应用SMOM技术不仅能在分子水平诊断FSHD，而且可以成为寻找FSHD新的分子遗传学病因的高效工具。