第一部分回肠转位术对非肥胖2型糖尿病的缓解作用背景2型糖尿病(Type2diabetes mellitus, T2DM)是在世界范围内广泛流行的危害人类健康的重要疾病,目前全球患者人数估计在2.8亿人左右,并且发病率逐年上升,预计到2030年时患者人数将超过3.6亿人。到目前为止还没有根治2型糖尿病的方法,当前的治疗方法包括饮食,运动,口服降糖药,注射胰岛素等措施目的在于控制血糖,预防并发症的发生。尽管通过严格地控制血糖,能明显降低糖尿病并发症的发生率,但是由于患者依从性的差异,糖尿病仍造成较高的致残率和致死率。越来越多的动物及临床研究表明各种减肥手术,特别是回肠转位术对2型糖尿病有较好的缓解作用。但是其机制目前还不明确,主要的解释有：减肥效果带来的抗糖尿病作用和不依赖减肥效果的抗糖尿病作用。后者是指胃肠道结构改变引起的胃肠道激素的变化所造成的血糖的改善,还可分为前肠假说和后肠假说。每种解释都相互独立,各有倾向。目前越来越多的2型糖尿病是非肥胖或者是不伴有病态肥胖的患者,对于非肥胖2型糖尿病患者,回肠转位术是否仍然存在确切的改善作用呢?没有了明显的减肥效果,其血糖的改善到底是哪种机制主导的呢?其之间有没有相互作用?为了探讨回肠转位术是否对非肥胖2型糖尿病有缓解作用,并讨论其缓解机制,本研究构建了非肥胖2型糖尿病回肠转位术动物模型。通过手术组与假手术组动物模型的比较,观察糖尿病的改善状况。并通过对代表各个机制假说重要激素等指标变化的对比与分析,讨论术后糖尿病改善的机制。方法本研究采用非肥胖2型糖尿病GK大鼠作为动物模型,随机分为3组：回肠转位术组(IT组)、回肠转位假手术组(S-IT组)、及空白对照组。回肠转位术是将距离回盲部5cm的一段10cm的回肠上提到距离Treiz韧带10cm处吻合；假手术组给予同样的横断位置,但是原位吻合。然后比较术前及术后各个实验组之间大鼠的摄食量及体重的变化、血糖状况、β细胞功能、瘦素水平、GLP-1水平及GIP水平等检测指标的变化。结果1.术后IT组和S-IT组大鼠的进食量和体重都明显下降(P<0.05),但是S-IT组大鼠的摄食量和体重在术后迅速回升,到术后第8周时与空白对照组无统计学差异(P>0.05)。而IT组大鼠的摄食量及体重一直维持在较低水平,始终低于S-IT组及空白对照组(P<0.05)。2.术后2周内IT组和S-IT组的血糖及口服葡萄糖耐量实验的AUCOGTT(?)低于术前(P<0.05),但是S-IT组的血糖后期与空白对照组无统计学差异(P>0.05),而IT组大鼠的血糖及AUCOGTT都显著低于S-IT组及空白对照组(P<0.05)。3.对胰岛素耐量实验各个时间点血糖的比较,术后IT组非肥胖2型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗得到显著的改善(P<0.05)；S-IT组大鼠的胰岛素抵抗无明显改善,并进行性恶化,与空白对照组无统计学差异(P>0.05)。4.通过空腹C-肽、空腹胰岛素的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测及葡萄糖-胰岛素释放实验发现：IT组非肥胖2型糖尿病大鼠p细胞分泌胰岛素的量增加(P<0.05),而S-IT组和空白对照组在术前术后无统计学差异(P>0.05)。5.IT组非肥胖2型糖尿病大鼠术后的空腹GLP-1水平增高,糖负荷后GLP-1分泌量增多(P<0.05)。而S-IT组和空白对照组在术前术后无统计学差异(P>0.05)。6.3组大鼠的空腹GIP及糖负荷后GIP分泌量术前及术后均无统计学差异(P>0.05)。7.IT组非肥胖2型糖尿病大鼠术前及术后的空腹瘦素均无统计学差异(P>0.05),但是糖负荷后AUCLeptin升高明显(P<0.05)。空白对照组术后36周的空腹瘦素比术前高(P<0.05)。结论本部分实验证实：1.回肠转位术对非肥胖2型糖尿病大鼠有明显、持久的抑制摄食的作用,使其体重增加得缓慢。2.回肠转位术对非肥胖2型糖尿病大鼠的血糖有迅速、明显、持久的改善作用。3.探究回肠转位术对非肥胖2型糖尿病大鼠血糖改善的作用机制发现：回肠转位术对非肥胖2型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗有显著和持久的改善作用,并且对非肥胖2型糖尿病大鼠的β细胞有改善作用,使胰岛素分泌量增加。4.对相关激素检测发现：回肠转位术后非肥胖2型糖尿病大鼠的血GLP-1水平增高,GIP分泌量术前及术后相比无统计学差异,瘦素分泌量的变化不大,但是瘦素分泌的敏感性改善了。统计学分析,GLP-1水平的升高对血糖的影响较大,呈线性相关。GIP及瘦素的改变对IT手术改善血糖的影响无统计学意义。上述发现表明,回肠转位术能显著改善非肥胖2型糖尿病患者的血糖,改善胰岛素抵抗,增加p细胞的胰岛素分泌量。对有关参与回肠转位术改善血糖机制可能激素的统计学分析显示,手术引起的GLP-1分泌增加发挥着主要作用。有关GLP-1的作用机制及下一步作用位点,尚待更深入的研究。第二部分下丘脑POMC神经元在回肠转位术缓解非肥胖2型糖尿病中的作用背景代谢综合征是多种代谢成分异常聚集的病理状态,葡萄糖代谢异常是其中一种表现。生理状态下哺乳动物的个体都处于精确的能量自动平衡中。下丘脑是调节机体能量活动的重要部位,有着许多的神经核团,参与着复杂的神经生理活动。POMC神经元作为存在于下丘脑的一类重要的神经元,可以抑制肥胖,产生较强的厌食感,被认为是食欲相关肽神经元,调控着摄食和机体能量平衡。该神经元分泌的POMC及其衍生肽等被认为是抑制摄食和增加能量消耗的肽类物质。POMC缺陷的大鼠常常伴有肥胖及糖尿病的症状。生理状态下POMC神经元可以被升高的GLP-1所激活,也能被降低的血糖水平所抑制。回肠转位术使得非肥胖2型糖尿病大鼠术后GLP-1的水平升高,但是血糖水平降低。其POMC (?)中经元是被激活还是抑制?回肠转位术对2型糖尿病的改善作用是不是通过POMC (?)中经元发挥作用的?到目前为止还没有相关的报道。因此本研究通过构建好的2型糖尿病回肠转位术模型,观察下丘脑中激活的POMC神经元数量及POMC翻译和表达的量。通过对回肠转位手术组与其他组动物模型的比较,探讨POMC神经元在2型糖尿病血糖改善中的作用,为揭示2型糖尿病发病机制及回肠转位术缓解2型糖尿病机制提供线索。方法将本实验第一部分存活的3组GK大鼠,在术后36周时处死,采集下丘脑组织和脑脊液等标本。免疫组织化学染色观察POMC神经元,对比组间大鼠下丘脑POMC神经元的个数；测量下丘脑POMC的mRNA转录量和POMC多肽的表达量；测量脑脊液中GLP-1、胰岛素和瘦素的含量,比较组间是否有统计学差异。结果1.接受回肠转位术的非肥胖2型糖尿病大鼠,术后36周下丘脑组织POMC mRNA的量比S-IT组和空白对照组都高(P<0.05),而S-IT组与空白对照组相比没有显著的差异(P>0.05)。2.IT组大鼠下丘脑POMC多肽含量比S-IT组高1.5倍(P<0.05),比空白对照组高1.6倍(P<0.05),S-IT组与空白对照组相比没有显著的差异(P>0.05)。3.IT组大鼠丘脑的POMC神经元个数多于假手术组和空白对照组(P<0.05)。4.经过ELISA检测,IT组大鼠脑脊液中GLP-1的浓度显著高于S-IT组大鼠及空白对照组大鼠(P<0.05)。5.IT组、S-IT组和空白对照组大鼠脑脊液中胰岛素的浓度无统计学差异(P>0.05)。6.IT组、S-IT组和空白对照组大鼠脑脊液中瘦素水平无统计学差异(P>0.05)。结论本部分实验证实：1.回肠转位术后非肥胖2型糖尿病大鼠下丘脑组织POMC mRNA的转录增多,POMC多肽表达增多。2.接受回肠转位术的非肥胖2型糖尿病大鼠下丘脑组织POMC神经元的数量增多。根据POMC神经元及POMC的作用,它可能参与回肠转位术改善血糖的机制。3.进一步探讨POMC被激活的原因,回肠转位术引起的GLP-1分泌增加可能发挥着主要作用。该实验首次将神经元作用与回肠转位术改善糖尿病联系在一起,发现其改变及可能的机制,为研究2型糖尿病及手术改善糖尿病提供新的思路。第三部分下丘脑POMC神经元在回肠转位术缓解非肥胖2型糖尿病中的机制背景POMC神经元被认为是食欲相关肽神经元,调控着摄食和机体能量平衡。它能够接受来自外周的信号,如：迷走神经传导的来自口咽、胃肠牵张感觉及肝脏代谢活动等所形成的刺激作用；循环中胃肠道分泌的脑肠肽及各种营养物质本身等。通过对这些信号的感知、整合反馈成脑内神经因子的形式。这些神经因子与其他的神经元相互联系,形成网络调控,对机体实时精确的应答反应。前部分实验发现IT手术后的大鼠血及脑脊液中GLP-1的水平明显增高。鉴于GLP-1可以通过自由扩散穿过血脑屏障,并且POMC神经元上有GLP-1的受体,因此可以推断POMC神经元可能被升高的GLP-1所激活。但是非肥胖2型糖尿病被回肠转位术所缓解的机制是否有激活的POMC (?)神经元参与呢?为了更好地探讨下丘脑POMC神经元在回肠转位术缓解非肥胖2型糖尿病中的机制,我们在接受侧脑室置管的非肥胖2型糖尿病大鼠中重新构建了回肠转位术模型。比较术前及术后脑脊液中多个时间点GLP-1水平的变化及血糖的变化,并且在大鼠侧脑室中给予GLP-1受体的拮抗齐(?) Exendin(9-39),观察拮抗后大鼠2型糖尿病的症状及POMC (?)神经元的变化。方法采用非肥胖2型糖尿病GK大鼠作为动物模型,给予大鼠侧脑室置管术,将存活的GK大鼠随机分为如下2组：IT组和S-IT组。术前及术后各个时间点监测体重、摄食、血糖及GLP-1等多个指标。在回肠转位术后4周时,对两组大鼠同时进行侧脑室GLP-1拮抗剂Exendin(9-39)的注射,然后比较两组大鼠的血糖及摄食等指标,观察GLP-1受体被拮抗后回肠转位术改善血糖的效果有无改变。术后6周处死所有大鼠,处死之前对IT组大鼠给同样剂量的Exendin(9-39),收集大鼠下丘脑等组织,组间观察比较GLP-1受体被拮抗后POMC神经元的状态。结果1.接受侧脑室置管的非肥胖2型糖尿病大鼠给予回肠转位术和假回肠转位术,术后4周IT组大鼠7只大鼠S-IT组5只大鼠一直存活到实验结束,但是IT手术组仅有6只大鼠的统计数据。2.两组大鼠术前的体重及摄食量无统计学差异(P>0.05)。回肠转位术后IT组大鼠的进食量显著低于S-IT组大鼠,体重也明显低于S-IT大鼠(P<0.05)。3.两组大鼠的血糖及AUCOGTT术前无显著性差异(P>0.05),回肠转位术后都出现了不同程度的血糖下降。IT组大鼠的血糖下降后始终处于较为平稳的状态,低于术前血糖水平(P<0.05)；S-IT组大鼠的血糖下降后呈现缓慢回升的趋势,与术前比较无统计学差异(P>0.05)。AUCOGTT曲线变化同血糖变化一致。IT组大鼠的AUCOGTT在下降后始终处于较低的状态,而S-IT组大鼠的AUCOGTT降低的不明显(P>0.05)。验证了回肠转位术对非肥胖2型糖尿病的缓解作用。4.回肠转位术后IT组大鼠脑脊液GLP-1水平不断升高,显著高于术前水平(P<0.05)。但是S-IT组GLP-1的水平波动不大,术后与术前水平相比无统计学意义(P>0.05)。5.回肠转位术后4周注射Exendin(9-39)前,IT组大鼠的摄食量比S-IT组大鼠少(P<0.05)。注射后IT组大鼠的摄食量明显增加(P<0.05),与S-IT组大鼠的摄食量相比无统计学差异(P>0.05)。S-IT组大鼠的摄食量与注射前相比无统计学差异(P>0.05)。注射前后两组大鼠的体重均无统计学变化(P>0.05)。6.注射Exendin(9-39)前,IT组大鼠的血糖低于S-IT组大鼠的血糖(P<0.05)。注射Exendin(9-39)后,IT组大鼠的血糖升高(P<0.05),与S-IT组无统计学差异(P>0.05)。S-IT组大鼠的血糖注射前后相比无统计学差异(P>0.05)。OGTT实验也发现注射Exendin(9-39)后,IT组大鼠的血糖峰值与S-IT组大鼠无统计学差异(P>0.05)。7.回肠转位术后6周注射Exendin(9-39)后IT组大鼠的下丘脑组织POMC mRNA的量比S-IT组低(P<0.05)。8.术后6周注射Exendin(9-39)后IT组大鼠的下丘脑组织POMC多肽含量比S-IT组低(P<0.05)。9.术后6周注射Exendin(9-39)后IT组大鼠丘脑的POMC神经元个数少于S-IT组(P<0.05)。10.术后6周注射Exendin(9-39)后IT组大鼠脑脊液中GLP-1的浓度高于S-IT组大鼠(P<0.05)。胰岛素的浓度无统计学差异(P>0.05)。结论本部分的实验结果表明：1.通过建立侧脑室置管的非肥胖2型糖尿病大鼠回肠转位术和假回肠转位术模型,再一次证实了回肠转位术对非肥胖2型糖尿病的治疗作用。摄食量减少,血糖及AUCOGTT得到明显的改善。2.回肠转位术后非肥胖2型糖尿病大鼠脑脊液GLP-1随术后时间不断升高,显著高于术前水平。3.术后注射GLP-1受体拮抗剂Exendin(9-39)能使非肥胖2型糖尿病大鼠已经改善的糖尿病症状恶化,血糖升高,摄食量增加。4.术后注射Exendin(9-39)可以明显抑制非肥胖2型糖尿病大鼠下丘脑组织POMC神经元。使其mRNA的表达减少,POMC多肽含量降低。但大鼠脑脊液中GLP-1的浓度仍高于S-IT组大鼠。因此非肥胖2型糖尿病大鼠下丘脑POMC神经元在回肠转位术后是被GLP-1所激活的,并且激活的POMC神经元在回肠转位术缓解非肥胖2型糖尿病中发挥重要作用。这为回肠转位术应用于临床以及进一步研究2型糖尿病提供一定的实验基础。