论文部分内容阅读
目的 采用SD雄性大鼠,腺嘌呤复制肾阳虚模型,观察萆薢分清饮对肾阳虚大鼠水液代谢紊乱的调节作用以及肾阳虚大鼠经V2R阻断剂OPC-31260、PKA阻断剂H-89干预后“AVP-V2R-cAMP-PKA-AQP2”通路的变化,初步揭示肾阳虚证水液代谢紊乱的机制以及萆薢分清饮调节肾阳虚证水液代谢紊乱的作用靶点。方法(1)取雄性SD大鼠70只用于制备肾阳虚模型,腺嘌呤200mg/kg灌胃造模,1次/天,连续21天;另取10只作为正常对照组,灌胃等量生理盐水。每4天检测一次大鼠的肛温、抓力,并记录大鼠的体重、竖毛、拱背、蜷缩、抓取激惹等体征症状。每7天上一次代谢,记录大鼠的饮食、饮水、尿量。末次造模前禁食不禁水12h,抽取10只模型组大鼠和正常组10只,眼眶取血,离心取上清液,用自动生化仪检测血清BUN、Scr含量;收集24h尿液离心取上清液,用自动生化仪检测U-TP含量,用酶联免疫吸附法检测尿液中17-OHCS含量;用酶联免疫吸附法检测血清ACTH、CORT含量,以观察模型是否成功。(2)造模成功后,随机将模型组分为肾阳虚模型组、模型+V2R阻断组、模型+PKA阻断组、萆薢分清饮组、萆薢分清饮+V2R阻断组、萆薢分清饮+PKA阻断组。萆薢分清饮组、萆薢分清饮+V2R阻断组、萆薢分清饮+PKA阻断组灌胃给予萆薢分清饮24.3g生药量/kg,1次/天,连续21天。在给药的第19天,V2R阻断组尾静脉注射OPC-31260 5mg/kg,PKA阻断组尾静脉注射H-89 400 μg/kg,1次/天,连续3天。(3)每4天检测一次大鼠的肛温、抓力,并记录大鼠的体重、竖毛、拱背、蜷缩、抓取激惹等体征症状。每7天上一次代谢,记录大鼠的饮食、饮水、尿量,最后一次代谢记录4h尿量。取最后一次代谢的尿量,离心取上清液,检测U-TP,用酶联免疫吸附法检测17-OHCS含量。第21天给药后,麻醉处死大鼠,心脏取血,用自动生化仪检测血清BUN、Scr含量,用酶联免疫吸附法检测血清AVP、ACTH、CORT的含量;分离心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、睾丸组织,计算脏器指数;取下丘脑制备匀浆,用酶联免疫吸附法检测CRH的含量;分离肾髓质并制备匀浆,用酶联免疫吸附法检测AQP2、V2R、cAMP、PKA、Epac、Ca2+的含量。结果(1)大鼠经腺嘌呤造模后,表现出体重增长缓慢,肛温降低,尿量增多,抓力降低、毛色无华、抓取激惹反应力下降等肾阳虚症状,大鼠血清ACTH、CORT和尿液17-OHCS含量显著降低,血清BUN、Scr和U-TP含量显著升高,综合各项指标说明造模成功。(2)给予萆薢分清饮21天后,大鼠的肾阳虚症状得到改善,体重增长加快,肛温、抓力升高,饮水量增多而尿量减少,肾阳虚大鼠血清AVP、ACTH、CORT以及尿液17-OHCS和肾髓质V2R、cAMP、PKA、AQP2、Epac含量含量显著升高,血清BUN、Scr和尿液U-TP含量显著降低。(3)连续3天尾静脉注射V2R阻断剂OPC-31260和PKA阻断剂H-89干预后,肾阳虚大鼠4h尿量显著升高,模型组内大鼠血清AVP含量及肾髓质V2R、cAMP、PKA、AQP2含量显著降低。(4)连续3天尾静脉注射V2R阻断剂OPC-31260、PKA阻断剂H-89干预后,萆薢分清饮组内的AVP、V2R、cAMP、AQP2、PKA含量均有显著性差异。结论(1)以200 mg/kg/d腺嘌呤混悬液灌胃21天,制备大鼠肾阳虚模型。模型动物较好地表现出“肾阳虚”形寒肢冷,精神不振,腰膝酸冷,小便清长,夜尿频多的症状,且显现出水液代谢紊乱的症状,肾阳虚证的动物模型复制成功。(2)萆薢分清饮能显著改善肾阳虚大鼠的一般症状体征、肾功能以及下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能紊乱。(3)萆薢分清饮提高“AVP-V2R-cAMP-PKA-AQP2”通路中 AVP、V2R、cAMP、PKA的表达,最终使AQP2的表达增加;其改善肾阳虚大鼠水液代谢紊乱的症状,其机制可能与“V2R-cAMP-PKA”通路有关。