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一、研究目标缺血性心脏病(Ischemic Heart Disease, IHD)是心脏疾病中最常见的一种疾病,在心脏缺血之后血管再通伴随着血液再灌会发生更严重的心肌缺血再灌注损伤(Myocardial Ischemia/Reperfusion, MI/R),是威胁人类生命健康的疾病。脂联素是脂肪细胞分泌的一种心肌保护细胞因子,可通过抑制心肌细胞凋亡显著降低MI/R损伤。近年来关于脂联素心肌保护的机制研究一直在不断进行,但脂联素心肌保护的详细途径尚未明确。有相关研究发现脂联素可通过钙网织蛋白(Calreticulin, CRT)及CD91共受体发挥保护心肌的作用。本实验旨在通过研究CRT/CD91共受体在脂联素抗心肌缺血再灌注损伤中的作用,明确CRT/CD91在脂联素的心肌保护中的具体机制,从而推动脂联素心肌保护作用研究工作的进展。二、研究方法1.通过小RNA干扰沉默小鼠心肌细胞及在体心肌组织的CRT及CD91(LRP-1),构建小鼠心肌缺血再灌注损伤模型。将70只C57BL/6J(20~25g)按照随机原则平均分为7组:手术对照组(sham);手术对照+Scramble SiRNA组(sham+ScrambleSiRNA);心肌缺血再灌注损伤组(MI/R+Scramble SiRNA);心肌缺血再灌注损伤+CRT基因组抑制组(MI/R+Calreticulin SiRNA);心肌缺血再灌注损伤+LRP-1基因组抑制组(MI/R+LRP-1SiRNA);心肌缺血再灌注损伤+CRT基因组抑制+APN治疗组(MI/R+Calreticulin SiRNA+gAPN);心肌缺血再灌注损伤+LRP-1基因组抑制+APN治疗组(MI/R+LRP-1SiRNA+gAPN)。检测各组心肌CRT和CD91(LRP-1)的表达水平,小动物超声检测左室射血分数、心肌Evan’s blue/TTC双染色检测心肌梗死面积,以及应用western blotting方法检测下游分子PI3K、Akt、eNOS的磷酸化表达水平。2.建立小鼠心肌缺氧复氧再灌注损伤模型,将SD大鼠出生1-3天雄性乳鼠30只,按照随机分配的原则分为6组:对照组(control);对照+Scramble SiRNA组(control+Scramble SiRNA);心肌缺血再灌注损伤组(MI/R+Scramble SiRNA);心肌缺血再灌注损伤+CRT基因组抑制组(MI/R+Calreticulin SiRNA);心肌缺血再灌注损伤+LRP-1基因组抑制组(MI/R+LRP-1SiRNA);心肌缺血再灌注损伤+CRT基因组抑制+APN治疗组(MI/R+Calreticulin SiRNA+gAPN);心肌缺血再灌注损伤+LRP-1基因组抑制+APN治疗组(MI/R+LRP-1SiRNA+gAPN)。检测CRT和LRP-1的表达水平,TUNEL细胞凋亡染色、Caspase-3活性检测、LDH释放量以及下游分子PI3K、Akt、eNOS磷酸化表达水平。三、试验结果1.小鼠在体心肌缺血再灌注损伤实验:1) Western blotting结果显示在小鼠心肌缺血再灌注损伤中CRT和LRP-1的表达水平显著上调(p<0.01),小鼠心功能下降、心肌梗死面积增加。2)分别使用CRT和CD91的特异性siRNA抑制CRT和CD91的基因表达以后,小鼠心肌中CRT和LRP-1表达水平明显下降,小鼠的心功能下降、心肌梗死面积增加。3)在用脂联素治疗以后,小鼠心梗面积和心功能均比使用siRNA组的小鼠显著改善,梗死面积显著减少,心功能显著恢复(p<0.01)。说明CRT和LRP-1参与脂联素保护小鼠心肌抵抗缺血再灌注的损伤4) Western blotting结果显示在小鼠心肌缺血再灌注损伤后,PI3k表达增加,Akt,eNOS的磷酸化表达上调。在分别使用CRT和CD91的特异性siRNA抑制CRT和CD91的基因表达以后,小鼠心肌中PI3k表达降低,Akt,eNOS的磷酸化表达降低。在脂联素治疗以后, PI3k表达增加,Akt,eNOS的磷酸化表达显著上升(p<0.01)。说明CRT和LRP-1参与脂联素在心肌缺血再灌注损伤的保护作用,通过PI3K/Akt/eNOS途径发挥作用。2.小鼠离体心肌细胞缺血再灌注损伤实验:1) Western blotting结果显示在心肌细胞缺氧复氧过程中CRT和LRP-1的表达水平显著上调(p<0.01),心肌细胞损伤和凋亡增加,caspase-3活性和LDH的释放明显增加。2)分别使用CRT和CD91的特异性siRNA抑制CRT和CD91的基因表达以后,心肌细胞损伤和凋亡增加,caspase-3活性和LDH的释放增加(p<0.05)。3)在用脂联素治疗后,心肌细胞的损伤和凋亡明显减少,caspase-3活性和LDH的释放显著减少(p<0.01)。说明CRT和LRP-1参与脂联素保护心肌细胞抵抗缺氧复氧损伤。4) Western blotting结果显示在心肌细胞缺氧复氧后,PI3k表达增加,Akt,eNOS的磷酸化表达上调。在分别使用CRT和CD91的特异性siRNA抑制CRT和CD91的基因表达以后,心肌细胞中PI3k表达降低,Akt,eNOS的磷酸化表达降低。在脂联素共孵育处理以后, PI3k表达增加,Akt,eNOS的磷酸化表达显著上升(p<0.01)。说明CRT和LRP-1参与脂联素在心肌缺血再灌注损伤的保护作用,通过PI3K/Akt/eNOS途径发挥作用。四、结论本课题在小鼠心肌缺血再灌注损伤模型和乳鼠心肌缺氧复氧模型中通过StealthRNAi基因沉默阻断CRT和CD91手段进行研究,有以下发现:1.小鼠在体心肌缺血再灌注和乳鼠心肌细胞缺氧复氧后,CRT和CD91(LRP-1)的表达水平明显增加,心肌细胞损伤和凋亡明显增加;分别使用CRT和CD91的特异性siRNA抑制CRT和CD91的基因表达以后,心肌细胞的损伤和凋亡加重,证明CRT和CD91可能是参与保护心肌缺血再灌注损伤;应用脂联素处理后心肌细胞的损伤和凋亡明显减轻,心功能明显改善;证明脂联素可以显著改善心肌缺血再灌注损伤。由此,证明CRT和CD91可能是脂联素保护心肌缺血再灌注损伤中重要分子。2. CRT和CD91下游的分子PI3K、Akt、eNOS磷酸化水平在小鼠在体心肌缺血再灌注损伤和乳鼠心肌细胞缺氧复氧后明显上调;使用Stealth RNAi阻断CRT/CD91基因表达之后,其表达水平均明显下降,在应用脂联素处理以后其表达明显上调。证明CRT和CD91介导脂联素激活下游的心肌保护性PI3K/Akt/eNOS通路而发挥作用。