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柑橘霉菌意大利青霉(Penicillium italicum)和指状青霉(P.digitatum)引起的青、绿霉病,是柑橘采后储运阶段最为严重的真菌病害。DMIs类杀菌剂能够防控此类真菌病害,但由此产生的耐药性问题日益突出。柑橘霉菌DMIs抗药分子机制研究备受关注。钙离子作为细胞第二信使与钙调素结合激活钙信号通路,参与调控真菌生长发育、形态建成、环境适应以及药物抗性。钙/钙调素依赖性蛋白激酶CaMK是钙信号转导中的蛋白质枢纽元件。该蛋白激酶在柑橘霉菌中的结构与功能尚未报道。比较研究意大利青霉和指状青霉CaMK,阐明其功能,有助于深入认识钙信号通路调控柑橘病原真菌生长发育、环境适应以及药物抗性的分子机制。本研究克隆了意大利青霉(青霉)和指状青霉(绿霉)钙/钙调素依赖性蛋白激酶基因CaMK1,通过构建CaMK1缺失突变株、回补株及其表型分析,阐明该基因对柑橘霉菌营养生长、毒力、环境刺激响应和DMIs唑类药物抗性的调控作用。主要研究结果如下:1.根据意大利青霉转录组解析的钙/钙调素依赖性蛋白激酶基因序列克隆了PiCaMK1。PiCaMK1的基因组 DNA(gDNA)和 cDNA 分别为 1379 bp 和 1209 bp,包含3个内含子,编码402个氨基酸。根据PiCaMK1基因比对获得指状青霉同源基因信息,克隆了 PdCaMK1基因。PdCaMK1的gDNA和cDNA分别为1373 bp和1221 bp,包含3个内含子,编码406个氨基酸。两类柑橘采后病原菌CaMK1序列相似性大于85%,都具有保守的丝氨酸或苏氨酸蛋白激酶催化结构域。运用同源重组基因敲除策略构建了意大利青霉和指状青霉的CaMK1缺失突变株,农杆菌介导青霉遗传转化构建了意大利青霉PiCaMK1回补菌株。2.比较分析了 CaMK1基因敲除对柑橘霉菌营养生长的影响。意大利青霉和指状青霉CaMK1缺失突变株生长缓慢。意大利青霉PiCaMK1敲除株接种后7 d的菌落直径(25.5 mm)比野生型菌落(53.5 mm)降低52.3%,菌落形态也有变化。PiCaMK1基因回补株生长速率恢复到野生型水平。指状青霉PdCaMK1敲除株接种后7 d的菌落直径(25.7 mm)比野生型(44.7 mm)降低42.5%。说明CaMK1参与调控两类柑橘霉菌的营养生长且作用趋势一致。3.比较分析了CaMK1基因敲除对柑橘霉菌产孢和毒力的影响。意大利青霉和指状青霉CaMK1缺失突变株产孢量下降到野生型的65.9%和64.2%。意大利青霉和指状青霉CaMK1缺失突变株在柑橘表面病斑扩散速度比野生型明显减弱,毒力分别下降到野生型的66.8%和67.5%。说明CaMK1参与调控两类柑橘霉菌产孢量和毒力且作用趋势一致。4.比较分析了 CaMK1基因敲除对柑橘霉菌DMIs抗性的影响。PiCaMK1基因缺失对于意大利青霉DMIs抗性的影响不显著。相比之下,PdCaMK1基因敲除显著降低了指状青霉对唑类DMIs的抗性,基因敲除菌株的咪鲜胺和抑霉唑EC50值分别降低到野生型的55.3%和61.9%。说明CaMK1对两类柑橘霉菌DMIs抗性有不同的调控功能。5.比较分析了 CaMK1基因敲除柑橘霉菌对环境刺激包括胁迫条件的响应。盐胁迫(如1.2 mol·L-1 NaCl或KCl处理)抑制意大利青霉野生型菌株生长(抑制率分别为15.2%、20.8%),PiCaMK1突变体的盐胁迫抑制率下降(分别为4.3%、7.4%),即PiCaMK1基因敲除提高了意大利青霉对盐胁迫的抗性;相同盐胁迫条件抑制指状青霉野生型菌株生长,但是PdCaMK1突变体的盐胁迫抑制率上升,即PdCaMK1敲除进一步降低了指状青霉的抗盐能力。渗透调节剂甘露醇(浓度0.6或0.9 mol·L-1)促进意大利青霉野生型和PiCaMK1突变体生长,野生型促进率高于突变体,但是对指状青霉野生型和PdCaMK1突变体生长的影响不显著。氧化胁迫因子H2O2(浓度6.0或8.0 mmol·L-1)促进指状青霉野生型和PdCaMK1突变体生长,野生型促进率低于突变体,但是对意大利青霉野生型和PiCaMK1突变体生长的影响不显著。以上结果说明CaMK1参与两类柑橘霉菌环境应激调控但有不同的响应机制。