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背景:急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一种血液系统恶性肿瘤,由骨髓和其他组织中淋巴祖细胞的增殖和积累引起。甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)是治疗ALL常规的化疗药物,为了获得良好的抗肿瘤效果,并减少MTX导致的毒副反应,需要随时监测MTX血药浓度。在用MTX治疗ALL过程中,会有一系列的毒副作用,其中外周血中的各种细胞因子发挥了重要作用,有限临床样本限制了检测多种细胞因子研究的可能。Th17细胞,是一类新发现的CD4+T细胞亚群,其分泌IL-17、IL-17F和IL-22细胞因子,尤其是IL-17,在宿主防御反应和自身免疫病中发挥重要作用,近些年来正成为研究热点。目的:探讨监测血药浓度的不同方法;MTX在治疗ALL中,与外周血淋巴细胞相关细胞因子的相关性研究。方法:(1)依据国家卫生和计划生育委员会颁布的WS/T 420-2013文件,对均相酶免疫法检测MTX的试剂盒做必要的实验室性能验证。(2)利用Luminex高通量液相分析平台,对MTX治疗ALL患者的血清中细胞因子进行高通量监测,利用这个平台检测外周血清中细胞因子的变化有利于了解病人的免疫状态,对临床的治疗及预后评估提供了重要免疫学证据。(3)通过体外细胞实验,观察MTX对外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的毒性、增殖以及IL-17表达的影响,研究其与MTX的药物浓度和处理时间有无计量相关性。结果:(1)通过精密度实验和稳定性实验结果发现,均相免疫法测得MTX低中高三个浓度(0.40μmol/L,0.80μmol/L,1.60μmol/L)的日内CV值分别为1.63%,1.67%和2.56%,;日间CV值分别为2.56%,1.17%和4.11%,均小于试剂盒厂家提供的CV(10%)。通过0d,4d和7d的相同标准品上机检测结果得知,MTX低中高三个浓度(0.40μmol/L,0.80μmol/L,1.60μmol/L)标准品在0天的CV值分别为(1.99%,4.74%,3.74%),4天的CV值分别为(3.09%,3.68%,0.75%)和7天CV值的分别(3.53%,4.89%,2.90%)均小于试剂盒厂家提供的CV(7%)。符合临床检测的要求。同时对Pearson相关检验示r=0.912,P<0.01,表明两组数据有较好的相关性,均相免疫法方法能够很好地与现有的化学发光法有较好的统一指示作用。(2)ALL组与对照组比较以下十五种细胞因子表达上调:IL-1ra,IL-5,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-15,Eotaxin,G-CSF,IP-10,MIP-1α,PDGF-bb,MIP-1β,RANTES和VEGF(P<0.05);以下七种细胞因子表达下调:IL-2,IL-12,IL-13,IL-17,FGF basic,GM-CSF和INF-γ(P<0.05)。MTX治疗组与ALL组比较以下六种细胞因子表达上调:IL-1ra,IL-8,IL-13,INF-γ,MCP-1和RANTES(P<0.05);以下八种细胞因子表达下调:IL-4,IL-9,IL-10,IL-15,IL-17,FGF basic,MIP-1α和VEGF(P<0.05)。(3)健康人外周血PBMC进行体外培养实验,用不同浓度MTX处理PBMC,设计不同的处理时间,通过CCK-8实验进行药物毒性检测;Elisa检测细胞培养上清液中的IL-17的含量;实时荧光定量PCR检测m RNA分子水平IL-17的表达量,发现PBMC中IL-17的分泌水平随着MTX计量和处理时间的升高而降低,m RNA分子水平的IL-17也随着MTX浓度的升高而降低。结论:(1)均相酶免疫法检测MTX的试剂盒在精密度,稳定性方面,与化学发光微粒子法比较,其相关性均符合国家卫生和计划生育委员会颁布的WS/T420-2013文件,符合临床检测标准。(2)ALL组与对照组细胞因子比较,在ALL患者中存在th1偏倚的免疫应答。MTX治疗组与ALL组比较,上调六种与炎症相关的细胞因子提示MTX的治疗会引起严重的炎症反应,有可能会引起病人的发热,全身性的炎症反应及炎症因子对机体各大器官的损伤,监测这些炎症因子有重要的临床意义。MTX下调八种与免疫细胞效应相关的细胞因子提示病人在治疗过程中免疫力会有不同程度的下降,同时提示MTX对IL-17的下调尤其显著,可以进一步探讨其发生机制。(3)MTX可能通过对外周血淋巴细胞的代谢途径直接影响IL-17的m RNA合成,进而影响IL-17的蛋白合成与分泌,对其影响机制可以在后续的工作中进行深入研究。