本文从4个灵芝菌株中克隆到灵芝免疫调节蛋白基因，分别命名为：gimp6、gimp9、gimp10、gimp11。对从灵芝菌丝体中克隆到的4个假定启动子片段进行了功能鉴定，并以之构建表达载体，成功建立银耳外源基因表达系统。最后构建灵芝免疫调节蛋白表达载体，在灰盖鬼伞和银耳中表达灵芝免疫调节蛋白。 1.灵芝免疫调节蛋白基因的克隆。采用同源克隆的方法，对6个灵芝菌株和1个云芝菌株进行基因组PCR，最终从4个灵芝菌株中克隆到4条与GenBank中灵芝免疫调节蛋白基因(lz-8)高度相似的序列：gimp6、gimp9、gimp10、gimp11。 核酸序列比对和氨基酸序列比对结果表明：gimp6、gimp9,、gimp10、gimp11与lz-8核酸序列相似度均大于97％，氨基酸序列相似度大于99％，为同一种蛋白的可能性分别为99％或100％。 故此判定gimp6、gimp9、gimp10和gimp11均为包含灵芝免疫调节蛋白cds全序列的DNA片段，并将该4条序列登录GenBank。收录情况为：gimp6：gb|AY449802.1|；gimp9：gb|AY449804.1|；gimp10：gb|AY449803.1|；gimp11：gb|AY449805.1|。 2.灵芝假定启动子功能鉴定。对4个灵芝内源假定启动子(glp14.1、glp17.1、glp26、glp31)进行活性鉴定。用灵芝内源假定启动子替换pBluescript-gfp表达载体中原有的双孢蘑菇gpd启动子，构建成6个灵芝启动子探测载体：pGFPglpl4.1、pGFPglpl7.1、pGFPglpl7.1R、pGFPglp26、pGFPglp26R和pGFPglp31。 利用PEG介导的原生质体转化方法，将灵芝启动子探测载体转入灰盖鬼伞，并检测各假定启动子的转录启始活性。实验结果表明：glp26在反向插入的情况下，具有转录启始活性，但荧光显微镜下，其转化子菌丝绿色荧光分布不均匀，具体原因仍有待进一步研究；glp31具有较强转录启始活性，荧光显微镜下，其转化子菌丝绿色荧光明亮。由于glp31与香菇gpd启动子具有98％相似性，因此认为glp31为灵芝gpd启动子，命名为glgpd2，并以之构建表达载体用于银耳外源基因表达。 3.灵芝免疫调节蛋白基因在灰盖鬼伞中的表达。构建灵芝免疫调节基因表达载体pEgimp，用PEG介导的方法，与色氨酸营养恢复型质粒pCcl001共转化色氨酸营养缺陷型灰盖鬼伞LT2菌株原生质体。液体发酵灵芝免疫调节蛋白基因灰盖鬼伞转化子，提取总蛋白，通过分子筛和阴离子柱分离纯化灵芝免疫调节蛋白。 4.银耳外源基因表达系统的建立。采用前述鉴定的灵芝gpd启动子(glgpd2)构建潮霉素(HmB)抗性载体pLBPHP和绿色荧光蛋白报告基因载体pLBGFP，并用于电击共转化银耳芽孢完整细胞。通过银耳培养基筛选、抗性试验、芽孢预处理、电击参数优化、转化子抗性筛选前预培养方法优化、拟转化子分子鉴定及绿色荧光观察等试验最终建立银耳完整细胞电击转化方法，并用于灵芝免疫调节蛋白的表达研究。潮霉素抗性基因(php)最高转化率为4.1个转化子/μgDNA，潮霉素抗性基因(php)与绿色荧光蛋白基因(gfp)共转化率约30％-40％。 优化后银耳(Tr01菌株)芽孢完整细胞电击转化参数如下： 用灵芝gpd启动子(glgpd2)构建表达载体；HEPES和醋酸锂预处理Tr01芽孢；电击体积为200μL；银耳芽胞浓度为1.0×10<8>个/mL；载体用量为6μg/电击；电击后用MA液体培养基26℃静置预培养48h；添加20mLMA半固体培养基(潮霉素10μg/mL)，26℃静置预培养15d进行转化子筛选，拟转化子无抗性平板转接2代(20d/代)后进行鉴定。 5.灵芝免疫调节蛋白基因在银耳中的表达。利用前述建立的银耳遗传转化方法，将抗性基因(php)和灵芝免疫调节蛋白基因共转入银耳Tr01芽孢，经PCR初步鉴定获得转化子。