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第一部分明确SD大鼠腹前侧耳蜗核GABAergic效应逆转时间 目的:听觉障碍是新生儿胆红素脑病的临床表现之一,但是具体机制不明。兴奋毒性是胆红素脑病导致新生儿听觉损害的关键环节。既往研究显示,GABA受体是中枢最主要的抑制性神经递质受体,大部分中枢神经系统的神经元在发育过程中都会经历GABA能(GABAergic)效应由去极化向超极化的转变。胆红素会显著增加未成熟听觉核团的GABAergic突触传递。我们猜测,胆红素可能通过增加去极化的GABAergic效应对未成熟神经元产生兴奋毒性。但是,腹前侧耳蜗核神经元GABAergic效应的逆转时间目前仍然不明。本研究旨在明确SD大鼠腹前侧耳蜗核神经元GABAergic效应的逆转时间及该核团内不同类型神经元GABAergic效应逆转的时间之间是否有差异,该项研究对于了解胆红素兴奋毒性对腹前侧耳蜗核不同类型神经元的作用时间及方式具有重要意义。 方法:急性单离出生后5到15天(postnatalday5-15,P5-15)的SD大鼠腹前侧耳蜗核,将神经元分为P5-7、P9-11、P13-15三组。联合形态学和膜片钳电生理的方法区分SD大鼠腹前侧耳蜗核的bushy细胞和stellate细胞。在穿孔膜片钳的电流钳模式下,给予细胞膜0pA的电流刺激,记录每个神经元的静息电位。在穿孔膜片钳的电压钳模式下,将细胞膜电位分别钳制在-80mV、-60mV、-40mV、-20mV、0mV,记录GABA(100μM)诱发电流,根据GABA诱发电流的幅度和与其对应的钳制电压大小,绘制电流-电压曲线,再利用Nemst公式计算GABA平衡电位,由GABA平衡电位和静息电位之间的差值判断此时GABAergic效应是去极化还是超极化,如果GABA平衡电位小于细胞静息电位,此时GABAergic效应引起细胞产生去极化,细胞的兴奋性增加;如果GABA平衡电位大于细胞静息电位,此时GABAergic效应引起细胞产生超极化,细胞的兴奋性降低。然后明确不同类型神经元(bushy细胞、stellate细胞)GABAergic效应逆转的具体时间有无差异及其产生机制。 结果:在bushy细胞中,GABAergic效应由兴奋性逆转为抑制性的百分比分别为:67%(P5-7组)、97%(P9-11组)和100%(P13-15组)。在stellate细胞中,GABAergic效应由兴奋性逆转为抑制性的百分比分别为:21%(P5-7组)、35%(P9-11组)和91%(P13-15组)。比较bushy细胞和stellate细胞静息电位之间的差异,发现两种细胞静息电位均值在P5-7组分别为-54.6±5.6mV和-60.6±3.7mV,在P9-11组为-56.7±3.7mV和-62.3±5.0mV,bushy细胞静息电位的数值均大于stellate细胞;然而在P13-15组两种细胞的静息电位数值无差异,分别为-61.7±3.2mV和-63.0±3.3mV。两种细胞的GABA平衡电位在P5-7组、P9-11组、P13-15组均无差异(分别为P5-7组:-58.3±8.8mVVS.-54.4±11.2mV、P9-11组:-62.8±5.5mVVS.-61.0±8.1mV、P13-15组:-70.4±7.2VS.-72.0±8.1mV)。根据GABA平衡电位和静息电位之间的差值,发现GABAergic效应在绝大部分的bushy细胞为超极化发生在P7,而其在绝大部分的stellate细胞为超极化发生在P13。 结论:SD大鼠腹前侧耳蜗核的bushy细胞和stellate细胞GABAergic效应逆转时间点不同,GABAergic效应在bushy细胞由去极化转变为超极化的时间发生在出生后第一周末,而GABAergic效应在stellate细胞由去极化转变为超极化的时间发生在出生后第二周末。不同类型细胞之间静息电位在发育过程中的差异可能是bushy细胞和stellate细胞GABAergic效应在不同时间点逆转的原因。更持久的去极化GABAergic效应可能导致stellate细胞比bushy细胞更容易在发育过程中受到胆红素的毒性损害。 第二部分牛磺酸在SD大鼠腹前侧耳蜗核激活GABAA-R和glycine-R的实验研究 目的:牛磺酸通过激活抑制性GABAA-R和/或glycine-R起到抑制性神经递质的作用,不同浓度牛磺酸在不同核团激活GABAA-R、glycine-R的类型也不尽相同。由于兴奋毒性是胆红素听觉中枢神经毒性的关键环节,我们猜想牛磺酸可能通过激活抑制性GABAA-R和/或glycme-R产生抑制效应,降低细胞兴奋性,从而拮抗胆红素兴奋毒性。但是,目前仍缺乏牛磺酸在SD大鼠腹前侧耳蜗核对以上两种受体激活作用的相关研究。该项研究不但为其他关于牛磺酸与腹前侧耳蜗核表面抑制性神经递质受体相互作用的研究提供了电生理依据,还为将牛磺酸作为一种有效的治疗新生儿胆红素脑病的药物提供了理论上的可行性。 方法:急性单离出生后13-15天的SD大鼠腹前侧耳蜗核神经元,采用全细胞膜片钳记录技术,观察牛磺酸与SD大鼠腹前侧耳蜗核神经元(bushy细胞、stellate细胞)GABAA-R、glycine-R的相互作用,以及不同浓度牛磺酸激活抑制性神经递质受体的类型是否有差异。将SD大鼠腹前侧耳蜗核神经元的膜电位分别钳制在-60mV、-40mV、-20mV、0mV、20mV,灌流牛磺酸、GABA、glycine,根据牛磺酸、GABA、glycine诱发电流的幅度和与其对应的钳制电压大小,绘制电流-电压曲线,再利用Nernst公式计算牛磺酸平衡电位、GABA平衡电位和glycme平衡电位,从三种激动剂平衡电位的数值大小接近何种离子平衡电位判断它们引起何种离子的跨膜流动。配制不同浓度牛磺酸(0.01mM、0.03mM、0.1mM、0.3mM、1mM)、GABA(0.001mM、0.003mM、0.01mM、0.03mM、0.1mM)和glycine(0.003mM、0.01mM、0.03mM、0.1mM、0.3raM),在全细胞膜片钳的电压钳模式下,将细胞膜电位钳制在-60mV,根据牛磺酸、GABA、glycme诱发电流的幅度和与其对应的激动剂浓度,绘制浓度-效应曲线,计算半最大效应浓度(concentrationfor50%ofmaximaleffect,EC50),比较三种激动剂对各自激活受体的亲和性。观察兴奋性氨基酸受体阻滞剂(NBQX、APV)对牛磺酸诱发电流的影响。研究三种激动剂诱发电流的相互作用。诱发电流通过膜片钳放大器后,经A/D、D/A转换器输入计算机,然后进行采样分析。<修稿日期>= 结果:牛磺酸、GABA、glycine的逆转电位分别为-10.9±2.4mV、-11.0±1.6mV、-11.8±1.1mV,均接近氯离子平衡电位-12.9mV,提示三种激动剂均能引起氯离子的跨膜流动。低浓度(0.1mM)、高浓度(1mM)牛磺酸诱发的电流,都被bicuculline(10μM,GABAA-R阻滞剂)部分阻断,联合加入strychnine(1μM,glycine-R阻滞剂)之后几乎完全被阻断,说明被阻断的电流其实是牛磺酸激活GABA-R和glycine-R诱发的,证实不同浓度牛磺酸均能激活GABA-R和glycine-R。牛磺酸的EC50为0.074mM,GABA的EC50为0.008mM,glycine的EC50为0.022mM,牛磺酸的EC50大于GABA/glycine的EC50,说明诱发同样幅度的氯离子跨膜流动,所需的牛磺酸浓度大于GABA/glycine,证实牛磺酸是GABAA-R和glycine-R的低亲和力激活剂,其对GABAA-R的激活效应低于GABA,对glycine-R的激活效应低于glycine。0.1mM牛磺酸诱发的电流幅度不受NBQX(AMPA受体阻滞剂)、APV(NMDA受体阻滞剂)影响,证实牛磺酸不激活兴奋性谷氨酸的AMPA受体和NMDA受体。同时灌流GABA和glycine诱发的电流幅度(actualcurrentsevokedbyacombinationofGABAandglycine,IGABA+Gly)小于单独灌流GABA诱发电流幅度与glycine诱发电流幅度之和(expectedsumofcurrentsevokedseparatelybyGABAandglycine,IEX(GABA+Gly),证实GABA和glycine诱发电流之间存在“交叉抑制”;而同时灌流牛磺酸和GABA诱发的电流幅度(actualcurrentsevokedbyacombinationoftaurineandGABA,ITau+GABA)大于单独灌流牛磺酸诱发电流幅度(taurineevokedcurrents,ITau),也大于单独灌流GABA诱发电流幅度(GABAevokedcurrents,IGABA),但是与单独灌流牛磺酸诱发电流幅度与GABA诱发电流幅度之和(expectedsumofcurrentsevokedseparatelybytaurineandGABA,IEX(Tau+GABA)之间无统计学差异,证实牛磺酸和GABA诱发电流之间不存在“交叉抑制”;同时灌流牛磺酸和glycine诱发的电流幅度(actualcurrentsevokedbyacombinationoftaurineandglycine,ITau+Gly)大于ITau,也大于单独灌流glycine诱发电流幅度(glycineevokedcurrents,IGly),但是与单独灌流牛磺酸诱发电流幅度与glycine诱发电流幅度之和(expectedsumofcurrentsevokedseparatelybytaurineandglycine,IEX(Tau+GIy))之间无统计学差异,证实牛磺酸和glycine诱发电流之间不存在“交叉抑制”。 结论:不同浓度牛磺酸均可激活SD大鼠腹前侧耳蜗核神经元的GABAA-R和glycine-R,这种效应是通过介导跨氯离子跨膜流动引起的。牛磺酸是GABAA-R和glycine-R的低亲和力激动剂。牛磺酸不激活兴奋性神经递质谷氨酸的AMPA/NMDA受体。GABA和glycine诱发电流存在“交叉抑制”,然而牛磺酸与GABA诱发电流、牛磺酸与glycine诱发电流之间不存在“交叉抑制”。牛磺酸对GABA/glycine诱发电流有协同效应。牛磺酸可能通过激活SD大鼠腹前侧耳蜗核神经元的GABAA-R和glycine-R降低神经元兴奋性,从而拮抗胆红素兴奋毒性。 第三部分牛磺酸通过激活GABAA-R/glycine-R拮抗胆红素所致SD大鼠腹前侧耳蜗核兴奋毒性 目的:胆红素脑病会造成新生儿一过性或永久性的听力损失,但是目前缺乏有效的治疗新生儿胆红素脑病的药物。牛磺酸是体内含量最丰富的氨基酸之一,主要通过激活GABAA-R和/或glycine-R起到抑制性神经递质的作用,也有神经保护作用。既往研究显示牛磺酸能拮抗胆红素引起的神经元兴奋毒性,但是只有形态学证据,缺乏对电生理机制的研究。本实验目的在于从电生理方面探索牛磺酸对胆红素所致SD大鼠腹前侧耳蜗核兴奋毒性的抑制作用及其机制,为临床治疗新生儿胆红素脑病提供实验基础和理论依据。 方法:急性单离出生后13-15天的SD大鼠腹前侧耳蜗核神经元,采用穿孔膜片钳记录技术,在电流钳模式下,给予细胞膜0pA的电流刺激,观察胆红素对神经元动作电位发放频率的影响。为研究胆红素对突触前谷氨酸释放的影响,在电压钳模式下,将细胞膜电位钳制在-60mV,观察胆红素对腹前侧耳蜗核神经元自发性兴奋性突触后电流(spontaneousexcitatorypostsynapticcurrents,sEPSCs)的作用。为探索胆红素对突触后谷氨酸受体敏感性的影响,研究胆红素、牛磺酸对谷氨酸诱发突触后电流(glutamateevokedcurrents,IGlu)的作用。将腹前侧耳蜗核神经元分为两组,第一组同时灌流胆红素和牛磺酸,记录神经元动作电位的发放频率;第二组同时灌流胆红素、牛磺酸、bicuculline(GABAA-R阻滞剂)和strychnine(glycine-R阻滞剂),记录神经元动作电位发放频率,并比较两组动作电位发放频率之间的差异。 结果:在电压钳记录模式下,胆红素能显著增加sEPSCs的发放频率,胆红素组sEPSCs发放频率为对照组的640.0±130.1%(P<0.01,n=6),两组sEPSCs的幅度无差异(P>0.05,n=6),证实胆红素能促进突触前谷氨酸释放。在电流钳记录模式下,胆红素诱发腹前侧耳蜗核神经元动作电位大量发放,胆红素组AP发放数量为对照组的848.0±223.2%(P<0.01,n=5),冲洗掉胆红素后,AP发放频率仍高于对照组,为对照组的623.3±290.9%,但是组间无统计学差异(P>0.05,n=5),证实胆红素会腹前侧耳蜗核神经元超兴奋,这种兴奋效应即使在冲洗掉胆红素之后的短时间内仍然存在。胆红素和牛磺酸均不影响IGlu的幅度(P>0.05,n=6),证实两者均不影响突触后谷氨酸受体敏感性。联合灌流胆红素和牛磺酸,神经元动作电位的发放数量较单独灌流胆红素组减少(P<0.01,n=6),冲洗掉牛磺酸后,动作电位发放频率下降,但是仍高于单独灌流胆红素组(P<0.05,n=6),证实胆红素能减轻胆红素引起的腹前侧耳蜗核神经元超兴奋;联合灌流胆红素、牛磺酸、bicuculline和strychnine,神经元动作电位发放数量与单独灌流胆红素组无明显差异(P>0.05),进一步证实牛磺酸激活GABAA-R/glycine-R参与其拮抗胆红素致神经元超兴奋的机制。 结论:牛磺酸通过激活GABAA-R/glycine-R拮抗胆红素所致腹前侧耳蜗核神经元神经元兴奋毒性,本实验为牛磺酸应用于临床治疗新生儿胆红素脑病提供了实验基础和理论依据。