前言　　特应性皮炎(atopicdermatitis，AD)，是一种较为常见的慢性炎症性皮肤疾病。特应性皮炎的病因与发病机制还不是很清楚，目前的研究认为可能是遗传因素，免疫因素与环境因素相互作用并通过免疫途径介导产生的结果。特应性皮炎多数在婴幼儿发病，典型分部的皮损和严重的瘙痒为本病的主要临床特点。　　特应性皮炎的临床诊断主要依靠患者的病史和临床表现，目前常用的国际诊断标准为Hanifin和Rajka制定的诊断标准和Willams诊断标准。SCORAD评分被用来评估疾病临床的严重程度。但SCORAD评分具有一定的主观性，主要依靠患者和医生的主观印象，因此在临床调查研究中，常需要两名皮肤科医生对患者进行评估。特应性皮炎患者的实验室检查无特异性，大多数患者的IgE水平和嗜酸性粒细胞均有不同程度的升高。研究证明，对AD儿童外用含有神经酰胺的保湿乳液，可以恢复患儿的皮肤屏障功能，缓解瘙痒。早期合理的防护可以增加皮肤含水量并维持皮肤屏障功能在最佳生理水平的最有效方法之一。因此，对于AD的早期诊断，并给予皮肤的保湿防护，可以有效控制疾病的发展，改善临床症状，提高患儿的生活质量。　　MiRNAs（microRNAs）是一类长度约为22-25nt大小的非编码RNA分子，由一段具有茎环结构的长度为70～80nt的单链RNA前体(pre-miRNA)剪切后生成。miRNAs通过RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)复合体和靶mRNA互补结合，抑制蛋白表达或促进蛋白降解。研究表明，miRNAs参与基因表达、细胞周期调控、和个体发育等多方面调控，而且，miRNAs在很多疾病中也有异常表达。miRNAs的异常表达和突变最多见于与肿瘤的发病有关。目前越来越多的研究表明，miRNAs和炎症性疾病如银屑病，和哮喘具有一定的相关性。而且，miRNAs在皮肤中的表达具有特征性，如miRNA-200家族（如miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141和miRNA-149），和miRNA-19、miRNA-20家族（如miRNA-19b、miRNA-20、miRNA-17-5p和miRNA-93）在表皮中优先表达，而miRNA-199家族(如miRNA-199a和miRNA-199b)仅在毛囊中表达。miRNA-203是皮肤特异性miRNAs，在皮肤中高水平表达，和表皮分化有关。这些研究表明miRNAs与皮肤疾病之间有着密不可分的关联。　　miRNAs在特应性疾病的发病中也起着重要的作用。miR-155在AD患者的皮损处皮肤表达升高，其主要作用是增加了T细胞的增殖性应答引发皮肤慢性炎症。这一过程是通过抑制CTLA-4来实现的，CTLA-4是T细胞活化的主要抑制剂，同时，CTLA-4也是miR-155的靶基因，AD患者的皮损处皮肤miR-155表达升高，抑制了CTLA-4的活性，因此，T细胞活化增强，T细胞的反应增殖性增强，引发皮肤慢性炎症。哮喘是AD的常见伴随症状，miR-126与哮喘的发病有关。miR-126表达升高可以诱发哮喘，抑制miR-126可以抑制IL-4介导的呼吸道炎症，从而抑制Th2介导的过敏性哮喘。　　人体各种组织中均有miRNAs的表达，如肝脏、心脏、肺等，而且，miRNAs在不同组织器官中的表达变化，对疾病的潜在信息有重要意义。miRNAs不仅在各种组织中稳定的表达，在血清中也有相当的数量的miRNAs存在，而且其表达相当稳定。通过测序对血清中主要的小核酸片段进行测序分析可以清晰的鉴别出miRNAs和其他小RNA，如rRNAs，或者降解的RNA片段，分析显示血清中存在有相当数量的不同来源的小RNA，长度在21-23nt，和miRNAs的长度一致。研究表明血清中的小RNA片段中包含丰富的miRNA，而且正常人的血清和血细胞中miRNAs的表达基本一致，和来自相同个体的血细胞比较，血清含有一个相对低水平的miRNA。且研究指出miRNAs不易被RNA酶裂解，是稳定存在的。在经过各种苛刻的条件处理后，包括煮沸，过于酸性或过于碱性，长时间储存，多次冻融等，血清miRNAs的稳定性尚好。RT-PCR分析，未经过任何处理的血清miRNA与经过各种苛刻条件处理后的血清miRNAs无显著性差异。大部分的miRNA在男性和女性受试者中的表达水平没有明显差异。至于血清中miRNAs的来源目前还不是很清楚。在疾病过程中，血清miRNA不仅来源于血细胞循环，也来源于其他受疾病影响的组织。因此，基于miRNAs的这些特性，这些与疾病相关的异常表达的特异性血清miRNA可以作为疾病潜在的生物标识物。除了血清，miRNAs也稳定存在于其他的体液中，如尿液、眼泪、羊水等。miRNA与特应性疾病的相关性研究尚少，尤其是体液miRNA在儿童AD患者中的表达情况目前国内尚无这方面的研究报道。本实验主要拟研究miRNA在中国儿童AD患者体液中的表达情况，以探讨特异性miRNA在AD发病过程可能介导的发病机制，为儿童AD的诊断寻找新的生物标识物。　　材料和方法　　一、研究对象　　1、实验组儿童AD患者30例，均符合Williams诊断标准。男22例，女8例，年龄范围在6个月至6岁，平均年龄1.9±0.32岁。入选患者均为中国汉族，均处于疾病的急性期，并采用SCORAD评分标准评估疾病的严重程度。所有患者就诊前3个月未接收系统性糖皮质激素治疗，及其他免疫抑制剂治疗。　　2、对照组儿童28例，来自儿外科的患者，受试者主要为血管瘤，隐睾等非系统性疾病，无湿疹病史。男24例，女4例，年龄范围在6个月至6岁，平均年龄2.1±0.16岁。所有入选受试者均为中国汉族，血清IgE水平均处于正常水平，均排除过敏性鼻炎、哮喘等过敏性疾病及其他系统性疾病。　　样品处理:每个受试者收集外周血2ml，尿液5ml，2小时内以2500g/min离心10分钟。分离血清及血细胞，尿液上清及尿沉渣。血清和尿液上清分装置于-80℃深冻冰箱保存备用。　　实验组及对照组所有受试者年龄、性别均具有可比性，并已排除精神、神经系统疾患，并告知其家属，由家长签订知情同意书。　　二、实验材料　　氯仿、无水乙醇、QiagenmiRNeasyMinikit、ABI公司TaqManMiRNA逆转录试剂盒、MegaplexRT引物、MultiScribe反转录酶、RNA酶抑制剂、PreAmpMasterMix、PreAmp引物、蒸馏水、TE液、enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)kit、RayBio(R)HumanCytokineAntibodyArraysV&5.1。　　三、实验方法　　1、应用TaqMan低密度芯片(TaqManLowDensityArray(TLDA)HumanmicroRNAPanelversion1.0)实验方法，寻找差异性表达miRNAs。　　2、应用Real-timePCR方法对芯片鉴定的差异性表达miRNAs进行验证。　　3、应用ELISA方法检测SOCS3和STAT3在血清中的表达情况。　　4、应用蛋白抗体芯片(RayBio(R)HumanCytokineAntibodyArraysV&5.1)实验方法，鉴定差异性表达的炎症因子。　　四、统计学分析　　统计方法主要为t检验、单因素方差分析、Pearsons相关性研究等，取P＜0.05具有统计学意义。统计学分析软件为SPSS18.0和GraphPadPrism5Project。　　结果　　1、儿童AD体液中miRNAs的表达情况　　(1)所有受试者的血清和尿液中且均检测到miRNAs的表达，miRNAs稳定的表达在儿童的体液中。　　(2)儿童AD的血清和尿液中miRNAs的表达都具有特异性，二者均检测出差异性表达的miRNAs。儿童AD血清检测到10种差异性表达的miRNAs，其中9种miRNAs表达升高，1种miRNAs表达下降。儿童AD尿液中检测出17种差异性表达的miRNAs，其中10种miRNAs表达升高，7种miRNAs表达下降。　　(3)血清和尿液中miRNAs表达具有一致性，在儿童AD的血清和尿液中均检测到miR-203、miR-483-5p和miR-205的存在。其中miR-203在血清中表达升高，而在尿液中表达降低;miR-483-5p和miR-205在血清中表达升高，在尿液中表达也是升高的。　　(4)Real-timePCR验证后得出，和对照组相比，儿童AD血清中miR-203和miR-483-5p表达升高，具有统计学意义。miR-483-5p与家族异位史有关，家族其他人伴有异位史的患者比个人伴有异位史的患者血清miR-483-5p的表达升高的更为显著。miR-203和miR-483-5p的表达和临床SCORAD评分具有正相关的趋势，但P值未达到统计学意义。尿液中miR-203表达降低且具有统计学意义。miRNAs的表达和患者的性别年龄无显著相关性。　　2、SOCS3和STAT3在儿童AD血清中的表达情况　　(1)儿童AD的血清SOCS3水平和对照组相比显著升高，儿童AD的血清STAT3水平和对照组相比也显著升高，且均具有统计学意义。　　(2)儿童AD的血清SOCS3水平与miR-203和miR-483-5p的表达具有相反的表达趋势，虽然分析显示P值未达到统计学意义，但对临床具有重大意义。　　(3)儿童AD的血清STAT3水平和临床SCORAD评分成正相关，且具有统计学意义。STAT3和SOCS3无明显相关性。　　3、儿童AD血清中炎症相关蛋白的表达情况　　(1)儿童AD血清中MIP-1β、sTNFRI、ICAM-1、sTNFRⅡ和MCP-1水平显著升高;IL-6sR和TIMP-2水平显著降低。　　(2)TIMP-2，sTNFRⅡ和MCP-1，3种炎症因子和临床SCORAD评分成正相关，sTNFRⅠ和sTNFRⅡ分别与miR-203成正相关。ICAM-1和SOCS3成负相关。　　(3)儿童AD血清中异常表达的七种炎症因子MIP-1β，sTNFRⅠ，ICAM-1，IL-6sR，TIMP-2，sTNFRⅡ和MCP-1在AD的发病过程中可能参与了效应细胞凋亡、Th2细胞应答、炎性细胞浸润，及瘙痒信号等调节作用，并和SOCS3/STAT3通路有关。　　结论　　1、miRNAs稳定的表达在儿童的体液中，包括血清和尿液。　　2、儿童AD的血清和尿液中均具有特异性的miRNAs表达模式。儿童AD血清中miR-203和miR-483-5p表达升高，尿液中miR-203表达降低。血清miR-203和miR-483-5p的表达和疾病的临床严重程度有一定相关性。　　3、儿童AD的血清和尿液在具有各自的特异性miRNAs表达模式的同时，部分miRNAs的表达具有一致性。　　4、miR-203和miR-483-5p可能通过SOCS3/STAT3路径及其相关的炎症因子相互作用，在儿童AD的炎症应答过程中起着重要的作用。　　5、miR-203和miR-483-5p有望成为儿童AD的生物标识物，有助于临床AD的早期诊断。