靶向性抗肿瘤药物是当今研究的热点。但抗肿瘤药研发的成功率仍很低,而有效性和安全性则是致使新药淘汰的两大因素,因此在新药发现早期建立高效候选药物筛选和优化的评价体系,预测其毒性及活性并全面快速评价其作用机制显得尤为重要。本文第一部分集中关注利用新型毒理药理学评价的代表技术----高内涵分析技术,对合成的候选化合物进行毒性活性评价,快速确定其作用机制。第二部分则主要建立利用高解析离子淌度质谱技术研究抗肿瘤药imatinib mesylate作用后的磷酸化蛋白质组变化的技术体系；同时对相关信号通路的磷酸化蛋白进行定量,为研究其潜在的新的分子机制提供线索。　　 ㈠采用高内涵分析技术研究抗肿瘤化合物的作用机制。高内涵分析技术是新型毒理药理学评价的代表技术之一。根据凋亡信号通路相关信息,利用已有的高内涵荧光细胞株和高内涵试剂,我们制定了一套抗肿瘤化合物作用机制快速筛选流程,对PAC-1及合成的PAC-1衍生物,以及合成的以Bcl-2家族蛋白为靶标的候选化合物进行了活性筛选和抗肿瘤作用机制研究。首先通过MTT实验初步筛选出对于肿瘤细胞系细胞活性具有较强抑制作用和选择性的候选化合物；随后通过高内涵实验进一步筛选能够诱导肿瘤细胞凋亡的化合物；再通过高内涵BrdU细胞增殖实验、高内涵AKT1-EGFP实验、高内涵Btk-PH结构域重分布实验、高内涵Ras激活重分布实验、高内涵MnSOD-pH2A.X实验等实验检测了化合物对细胞周期、凋亡相关信号通路、细胞氧化胁迫反应等参数的影响,快速确定了其活性及作用机制；最后利用Western blot实验对所得结论进行了验证。研究发现,化合物YCL0426和Z-36对肿瘤细胞增殖具有较强的抑制作用。YCL0426可诱导HcpG-2细胞凋亡,而相同浓度下不产生明显非凋亡毒性；它使肿瘤细胞发生明显的G1/S期阻滞；其在作用早期即可诱导肿瘤细胞发生DNA损伤,能够诱导DNA双链断裂并触发其修复机制；同时它对PI3K-AKT1相关信号通路无抑制活性,也不诱导肿瘤细胞产生氧化胁迫反应。Z-36未使HepG-2细胞出现典型凋亡特征；它对PI3K-AKT1通路和Ras-Raf通路均有抑制作用；而几乎对细胞周期时相分布、细胞中氧化胁迫反应及DNA完整性均无影响。则其作用靶标很可能是位于两通路上游的共同信号蛋白。本研究通过制定的高内涵分析实验流程筛选并确定两个抗肿瘤候选化合物的作用机制。其中YCL0426通过促使DNA双链断裂诱导肿瘤细胞凋亡,作用机制不同于其先导化合物PAC-1；Z-36可抑制PI3K-AKT1通路和Ras-Raf通路上游的蛋白靶标,这很可能与其诱导肿瘤细胞自噬密切相关。　　 ㈡采用高解析离子淌度质谱技术探讨抗肿瘤药Imatinib Mesylate(格列卫)作用新的分子机制。蛋白质组学在全面评价药物作用机制、发掘新的作用机理研究方面具有不可替代的优势。由于蛋白质的许多功能来自于翻译后修饰,作为最为重要的蛋白质翻译后修饰和许多肿瘤发生的原因,磷酸化蛋白质组学研究日益受到关注。随着高解析MS技术的发展,通量鉴定药物引起的蛋白磷酸化变化并分析其磷酸化位点成为可能。但利用HDMS技术研究蛋白磷酸化变化,特别是很多抗肿瘤药诱导的蛋白磷酸化变化(多为激酶抑制剂)还不很完善。本实验选择作用机制较明确的靶向抗肿瘤药Imatinib Mesylate(格列卫,其后简称为imatinib)作为研究对象,研究其作用于CML,细胞后的磷酸化蛋白质组变化。通过完善技术体系,研究未知蛋白质磷酸化水平变化,探讨imatinib潜在的新作用机制。本研究通过MTT实验确定了imatinib对CML细胞系K562细胞的明确靶向性和大致作用浓度范围。随后,通过HCA系统检测imatinib处理后ERK MAPK的磷酸化水平的动态变化曲线。以其作为质量控制手段,确定了浓度0.03μM、0.1μM,作用30 min后的蛋白样品用于质谱检测。最后,通过SILAC标记技术及TiO2磷酸化肽段富集技术,采用HDMS检测了各组样品的磷酸化蛋白质组变化。实验中共鉴定出323个磷酸化肽段、219个磷酸化位点。通过蛋白相对定量分析,发现imatinib作用后下调的磷酸化位点7个,上调的磷酸化位点41个,新的磷酸化位点7个。对差异磷酸化蛋白的定位和功能进行分析显示,大部分蛋白位于细胞核并与核酸转录和翻译过程密切相关。结合文献分析结果,确定了实验体系的可靠性；并对eIF类蛋白及MCM2蛋白不同位点磷酸化的功能或调节机制进行了分析探讨。本研究初步确立了以HCA及HDMS技术相结合研究抗肿瘤候选化合物作用机制的技术体系。发现0.03μM、0.1μM的imatinib作用K562细胞30 min其磷酸化信号已传至细胞核,并主要体现在对核酸转录及翻译的生物学过程的调节。本研究为探讨imatinib潜在的作用分子机制,丰富其药理学作用谱研究奠定了基础。