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γ-多聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)是微生物合成的一种阴离子型高聚物,由于大量游离羧基存在于其分子链上,因此γ-PGA具有极强的吸水能力(最高可达1∶3,500倍)。现有报道说明γ-PGA在农业、食品工业、制药业和环境修复等领域具有广泛应用前景。然而现阶段其发酵培养基中需要加入大量丰富碳源如葡萄糖、柠檬酸等,导致其生产成本较高。因此寻找易于获取且价格低廉的生物质资源作为生产γ-PGA的替代底物是一种极具经济性地探索。 全球每年通过光合作用生产的木质纤维素资源高达1,000亿吨,因此木质纤维素是地球上最丰富的生物质资源之一,但遗憾的是其中89%尚未被利用。然而由于缺乏先进预处理及利用技术,目前我国对木质纤维素资源的任意丢弃和不合理处理(如直接焚烧)已经造成了极大的资源浪费和环境污染,因此,推进木质纤维素资源的高效利用方法和技术势在必行。木质纤维素水解产物中能够被有效利用的主要是葡萄糖和木糖,而自然界中微生物存在的碳代谢抑制效应阻碍了其对木质纤维素资源的充分利用。因此本研究首先从土壤中自主筛选的一株产γ-PGA的菌株Bacillus amyloliquefaciens C1并以此为目标菌株,研究了其在混合糖(葡萄糖和木糖)培养条件下的碳源利用特征,并通过异源表达技术将γ-PGA合成基因克隆到大肠杆菌中表达,具体内容包括: (1)从土壤中筛选出1株产γ-PGA的细菌C1,在添加底物谷氨酸10g/L的条件下,30℃、170 r/min液体摇瓶发酵48 h,γ-PGA产量可达到18.4 g/L。经16S rDNA鉴定,C1菌是一株解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),该菌株为γ-PGA的研究应用提供了较为理想的研究对象。 (2)通过生长曲线和糖耗实验证明了解淀粉芽孢杆菌C1可以利用木糖作为唯一碳源生长代谢,利用混合糖生长代谢时存在碳代谢抑制效应。基因表达量的检测发现,葡萄糖的存在抑制了基因xylA和xylB的表达,但没有抑制基因araE的表达,说明木糖被抑制仅局限在xylAB基因水平上。培养基中添加前体谷氨酸10g/L,解淀粉芽孢杆菌C1利用充足的木糖,葡萄糖以及玉米芯水解液发酵72h分别可以合成γ-PGA8.96 g/L,6.08 g/L,5.56g/L。此结果为解淀粉芽孢杆菌充分利用木质纤维素资源提供了一定的基础。 (3)利用SEFA-PCR方法成功扩增出菌株B.amyloliquefaciens C1中负责γ-PGA合成的全长基因簇pgsBCAE,并将其克隆入表达载体质粒pET29a(+)中,该载体质粒转化宿主细胞E.coli BL21(DE3)后,在IPTG诱导下能够发酵生产0.14 g/Lγ-PGA。并且Mn2+和Zn2+等金属离子能够调控重组子E.coli BL21(pET29α-pgsBCAE)发酵合成γ-PGA的产量,该结果为合成并调控γ-PGA的微生物合成提供了一定的思路。