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在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)和苹果酸酶(Malic enzyme,ME)是与油脂积累相关的两个关键酶。G6PD是磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway,PPP)中的第一个酶,催化一个限速反应,即氧化葡糖糖-6-磷酸生成6-磷酸葡萄糖酸-δ-内酯,同时伴随着NAD(P)+的还原。ME则是调控苹果酸代谢的关键酶,催化L-苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸、NAD(P)H和CO2。除了NAD(P)+以外,苹果酸酶催化的反应还需要二价金属离子的参与。这两个酶都是细胞内NADPH的重要来源,其产生的NADPH可用于生物合成及维持生物体的抗氧化系统。本研究成功表达并纯化了解脂耶氏酵母G6PD(Yl G6PD)和ME(Yl ME),并对它们的酶学性质进行了详细鉴定,以及通过定点突变转变了它们各自的辅酶依赖性。研究结果如下:1.Yl G6PD的表达、纯化和酶学鉴定本研究在大肠杆菌中成功表达了Yl G6PD,并通过Co2+亲和层析纯化得到了纯酶。SDS-PAGE和凝胶过滤层析揭示Yl G6PD是一个219 k Da的同源四聚体酶。Yl G6PD的最适反应p H值和最适反应温度分别为p H 8.5和47.5°C。热失活研究表明在48°C条件下孵育20 min,Yl G6PD的活性大约丧失一半。动力学分析显示Yl G6PD是依赖于NADP+的酶,以NAD+为辅酶时,Yl G6PD没有活性。并且Yl G6PD对底物葡萄糖-6-磷酸和辅酶NADP+的Km值分别为261μM和34.12μM。NADPH是Yl G6PD对NADP+的竞争性抑制剂,测得的Ki值为56.04μM。2.Yl ME的表达、纯化和酶学鉴定本研究在大肠杆菌中成功表达了Yl ME,并借助Co2+亲和层析得到了纯酶。SDS-PAGE测得Yl ME的亚基分子量大约为69 k Da,凝胶过滤层析计算得到的分子量大约为144 k Da,因此Yl ME是一个同源二聚体酶。Yl ME的最适p H和最适温度分别p H 5.8和25°C。热失活分析表明,在33°C条件下孵育20 min,Yl ME丧失大约50%的活性,说明Yl ME的热稳定性较差。动力学数据揭示Yl ME是NAD+依赖性酶,且对NAD+的偏好性大约是其对NADP+的38倍。Yl ME对NAD+和NADP+的Km值分别为672.30μM和2180μM。有趣的是,Yl ME受底物苹果酸的别构调节,测得的S0.5值和希尔系数(Hill coefficient)分别为58.20 m M和2.16。3.Yl G6PD和Yl ME的辅酶特异性改造为了改造Yl G6PD和Yl ME的辅酶特异性,我们根据基于结构的氨基酸序列比对结果,构建了4个突变体酶,分别是Yl G6PD突变体酶R52D、R52D/S53Q、R52D/S53Q/Y93V和R52D/S53Q/Y93V/A124S。动力学分析表明这4个突变体酶都不能利用NADP+,且最好的突变体酶R52D/S53Q/Y93V/A124S对NAD+的催化效率(kcat/Km)为25.6 s-1M-1;同理,构建了Yl ME两点突变体酶M388V/P391K,与野生型Yl ME相比,M388V/P391K突变体酶对NAD+的亲和力降低了4.77倍,对NADP+的亲和力升高了3.6倍,M388V/P391K对NADP+的亲和性是其对NAD+亲和性的5倍左右。YIME辅酶特异性的进一步改造工作正在进行中。本研究对解脂耶氏酵母中心代谢的两个关键酶Yl G6PD和Yl ME进行了详细的酶学鉴定以及功能改造,揭示了Yl G6PD和Yl ME中与辅酶结合相关的氨基酸的重要性,丰富了这两种酶的生化信息,为酵母的代谢工程研究提供了科学依据。