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近年来在手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)中,柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A16,CV-A6)是爆发流行中较活跃的病原体之一。有相关数据指出,柯萨奇病毒A组6型可以通过人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD)进行培养,却很难在常用的疫苗生产基质细胞(如Vero、MRC-5等)中进行培养,从而给柯萨奇病毒A组6型病毒疫苗的研发带来了极大的障碍,目前临床上缺乏相关对CV-A6治疗的特效药物和疫苗,所以进行CV-A6的细胞感染机制研究,及相关单价多价疫苗的开发已迫在眉睫。CV-A6复制期间不经历DNA的中间阶段,使重组DNA技术不能直接适用于分析和病毒基因组的研究,同时病毒RNA分子的体外稳定性也给相关研究的开展产生了很大的困难。这使我们非常需要人为控制编辑RNA病毒基因组的操作技术。经过科学家们不断的改进,反向遗传学技术应运而生,此技术可以将基因操作技术针对病毒基因组的全长c DNA进行开展。这项技术,使得RNA病毒在人为条件下经历DNA的中间阶段,这有助于我们在DNA水平上进行CV-A6病毒深入研究,同时我们也通过相关的基因水平上的操作对CV-A6基因组进行改造,以探究CV-A6相关细胞感染性机制,并尝试构建一种同时具有CV-A6和CV-A16两种抗原位点的重组病毒,为后续研发柯萨奇CV-A6与CV-A16双价疫苗提供基础。在第一部分中,我们首先提取并分离了手足口病病人疱疹样标本中的CV-A6病毒,通过空斑纯化得到了七株病毒株,并分别对七株病毒株展开细胞感染性的相关研究,我们发现七株病毒株都能顺利感染人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD)。但是这七株病毒株却无法在Vero细胞上感染,这也给CV-A6疫苗开发带来不小的阻碍。而作为手足口病柯萨奇病毒中另一家族成员的CV-A16却能同时感染RD与Vero细胞,这引起了我们的兴趣与重视。最后,我们进行了CV-A6毒株相关的鉴定,通过电泳及测序鉴定了CV-A6七个毒株的基因序列,在此基础上利用软件分析了其系统发育树图谱,并测定了各毒株的滴度,选取了滴度最高的CV-A6病毒株XS45进行后续实验探究。第二部分中我们利用反向遗传技术分别构建了CV-A6和CV-A16的全长c DNA。并在此研究基础上,利用Overlap PCR拼接出了重组病毒(CA16-CA6VP)基因组c DNA,重组病毒(CA16-CA6VP)c DNA序列是由CA6-VP段替换原CA16-VP段,并在上下游引入了适合的酶切位点与T7启动子序列得到的。将上述三种病毒的c DNA通过与p BM16A-TOPO载体的连接,我们构建了三种p BM16A-CA6,p BM16A-CA16,p BM16A-Re(CA16-A6VP)感染性克隆。通过测序鉴定,与设计的理论序列一致,为我们第三部分鉴定及其感染性探究打下了基础。第三部分中我们将对构建的三种p BM16A-CA6,p BM16A-CA16,p BM16A-Re(CA16-A6VP)感染性克隆展开细胞感染性研究相关的探索。我们将三种感染性克隆通过设计的酶切位点双酶切线性化,经体外转录成RNA,然后通过脂质体共转染细胞,盲传三代适应,展开对重组病毒的感染性相关研究。我们对三种盲传适应的重组病毒的基因组序列进行分析,病毒间接免疫荧光,细胞显微镜形态学观察,滴度检测等。我们对比发现,通过反向遗传技术构建得到的重组CV-A6,CV-A16具有与亲本母毒株相似的性状,在细胞感染性上基本一致。而构建得到的重组病毒(CA16-A6VP)是以CV-A16为基本,将CV-A6-VP替换了其VP段。在后续滴度测定中,重组病毒其滴度高于母本病毒CV-A16和CV-A6,但在细胞感染性上表现了与CV-A6病毒感染性一致的情况,即能感染RD细胞却无法正常感染Vero细胞。这一细胞感染现象提示我们病毒VP段结构可能是病毒感染细胞相关位点的重要结构基础,病毒VP段中可能存在相关基因调控蛋白,影响病毒吸附细胞途径。实验成果:1.成功从病人疱疹样品中分离(A:XS45,B:JB66,C:JB70,D:IB69,E:JB71,F:XS46,G:JB68)七个毒株并对细胞感染性展开研究。2.研究利用反向遗传技术构建CV-A6,CV-A16感染性克隆并转染细胞,经全基因测序分析,RT-PCR,免疫荧光鉴定,成功获得CV-A6,CV-A16重组病毒。3.CV-A6,CV-A16重组病毒和母本野毒株表现相同的细胞感染性。4.在此基础上,构建的重组病毒(CA16-A6VP)毒力显著高于原母本双亲。重组病毒(CA16-A6VP)表现与CV-A6母本相同的细胞感染性,感染RD细胞,无法在Vero细胞上培养。5.CV-A6的细胞感染性感染应与其病毒VP结构有关,VP结构上可能有相关区域(P1,P2,P3)位点调控其细胞感染性。6.已经建立一套稳定的上游分子生物学技术,通过此技术可以替换,突变相关结构及位点,展开对柯萨奇病毒的相关分子生物学研究及双价,多价嵌合疫苗的研究。综上所述,利用反向遗传技术,我们就能人为构建适于研究的重组病毒,可以尝试通过设计位点以及定向突变,或者替换整段基因的方式来研究病毒基因相关的功能,进一步深入研究病毒感染细胞的致病机理,为研制多价疫苗提供了很好的平台和材料,为后续研发疫苗等各方面研究打下基础。