研究背景：慢性粒细胞白血病(CML)是一类发生在造血干细胞的以髓系细胞慢性增殖为主要特征的恶性克隆性疾病,95%的患者骨髓中可找到Ph染色体,即t(9；22)(q34；q11),这一易位使正常位于9q34染色体的C-ABL1基因与22q11染色体的BCR基因发生融合,形成BCR/ABL融合基因。该基因是恶性克隆的分子生物学标志,表达具有高度酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白,导致髓系细胞的过度增殖和分化。CML占成人白血病的15%,全球年发病率为1.6-2.0/10万。我国1986-1988年进行22个省(市、自治区)46个调查点的全国白血病发病情况调查结果显示,CML的年发病率为0.36/10万,低于西方国家,但中国CML患者较西方国家患者年轻,中位发病年龄为45-50岁,而西方国家的CML中位发病年龄为67岁。Ph染色体或BCR/ABL融合基因是CML的特征性标记,对CML的诊断、治疗效果随访评估及微小残留病灶(MRD)监测具有重要意义。细胞遗传学[包括骨髓染色体核型分析和荧光原位杂交技术(FISH)]和分子学[逆转录荧光定量PCR(RQ-PCR)]方法是检测的主要方法。CML患者在移植后BCR/ABL融合基因再次转为阳性或拷贝数增多则提示分子生物学复发,随后才表现为细胞遗传学复发和血液学复发。染色体分析及FISH灵敏度远不如PCR方法,且操作复杂,耗时较长,其在监测MRD中的应用受到了较大限制。移植后采取PCR方法监测BCR/ABL融合基因的表达对于追踪检测残留病变,早期预测复发具有重要价值。PCR方法具有特异性强,灵敏度高,方便快捷,高效安全,较少标本即能满足检测的优点。但血液和骨髓中可能存在各种各样的PCR反应抑制物,如抗凝剂、血红蛋白、钙离子等,这些PCR反应抑制物或多或少能影响PCR反应的灵敏度和精确度。本课题第一章节将探讨抗凝剂肝素对荧光定量PCR法检测BCR-ABL基因结果的影响。CML的治疗目标是尽快达到完全细胞遗传学反应(CCyR)和更深的分子学缓解,以及提高患者生活质量和功能性治愈。异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前唯一有望治愈CML的方法,但随着伊马替尼等酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的问世,其在CML治疗中的一线治疗地位受到挑战,被美国国立综合癌症网络(NCCN)推荐为CML的二线治疗。Allo-HSCT往往受限于供者有无、患者年龄等多种因素,伊马替尼作为一线治疗药物可使CML患者的10年生存率达85%-90%,因此目前伊马替尼逐步取代造血干细胞移植成为首选一线方案。但伊马替尼等TKIs药物价格昂贵,大多数患者无法长期承受,而且在服用伊马替尼期间,仍有不少患者CML疾病进展或发生耐药。中国CML患者发病年龄往往较西方国家低,对治愈的要求更为迫切。结合中国国情,造血干细胞移植仍不失为CML的重要治疗手段。伊马替尼属于TKIs药物,其药理作用多样,其毒副作用可分为近期和远期毒副作用。常见的近期毒副作用主要有胃肠道反应、水钠潴留、骨髓抑制等,近期毒副作用大多出现在治疗后的前两年,多数作用较轻微,通过减药或停药可得以恢复。近年来伊马替尼的一些远期毒副作用也逐渐被人们认识,如心脏毒性、骨质代谢异常、胎儿致畸作用、男性乳房发育、甲状腺功能低下、免疫功能紊乱、皮肤毒性、肝脏毒性、肺脏毒性、继发第二肿瘤等,这些远期毒副作用往往起病缓慢、发生隐匿且呈进行性不可逆发展,对患者长期生存质量产生深远影响。造血干细胞移植通常采用超大剂量化疗或放疗预处理,并移植后长期服用免疫抑制剂等,在此应激条件下,即使应用伊马替尼治疗时间较短,其相关早期及远期毒副作用也可能提早显现。伊马替尼的上述毒副作用是否会对CML移植患者造血重建、移植相关并发症、总生存(OS)、无进展生存(PFS)、无复发死亡(NRM)等产生影响呢?之前应用伊马替尼治疗的CML患者接受造血干细胞移植时风险是否会增加?移植相关并发症发生率是否会增加?预后是否变差?值得关注。本课题第二章节回顾性分析本院97例CML造血干细胞移植患者的病例资料,研究移植前应用伊马替尼治疗(不少于3个月)对CML造血干细胞移植造血重建时间和急性心力衰竭、急性移植物抗宿主病(aGVHD)、肝静脉闭塞病(HVOD)、出血性膀胱炎、病原体(细菌、真菌和病毒)感染事件等移植相关早期并发症,以及早期移植相关死亡(TRM)、慢性移植物抗宿主病(cGVHD)和远期总生存(OS)的影响。第一章节肝素抗凝标本对荧光定量PCR检测BCR-ABL P210基因结果的影响研究目的：传统观点认为肝素对PCR反应具有明显的抑制作用,肝素抗凝标本不能用于临床PCR检测。本章节将探讨肝素抗凝标本对荧光定量PCR(RQ-PCR)检测BCR-ABL P210基因的影响特点。研究方法：运用本实验室RQ-PCR系统检测标本的BCR-ABL P210基因及ABL基因表达情况。用K562细胞悬液模拟骨髓和外周血,探讨肝素对RQ-PC检测BCR-ABLP210基因的影响特点,并尝试寻找一个合适的肝素浓度区间,在此区间内肝素既可以发挥良好的抗凝血功能,又能不影响肝素抗凝标本用于临床PCR的检测。在获得上述肝素浓度区间之后,用临床标本(骨髓或外周血)进行验证。研究结果：①肝素对PCR反应确实有着明显的抑制作用且存在剂量依赖效应；②PBS缓冲液预处理可有效降低肝素对PCR的抑制作用；③标本经PBS预处理后,肝素浓度区间在0-196U/m1时可用于PCR检测。研究结论：临床上我们用肝素抗凝标本时,肝素浓度一般介于10-50U/ml之间。肝素标本在提取核酸前进行PBS缓冲液预处理后,可安全用于RQ-PCR检测BCR-ABLP210基因。第二章节移植前应用伊马替尼治疗对慢性粒细胞白血病移植患者造血重建、移植并发症及预后等影响的临床研究研究目的：研究移植前应用伊马替尼治疗对慢性粒细胞白血病(CML)异基因移植患者造血重建、移植相关并发症以及预后等的影响。研究方法：回顾性分析南方医院血液科2003年5月至2013年5月收治的97例(删去9例移植前应用伊马替尼治疗时间少于3个月的病例)行异基因移植CML患者病例资料,依据移植前有无应用伊马替尼治疗史且累计治疗时间不少于3个月,将病例资料分为伊马替尼组(27例)与对照组(70例),运用Fisher确切概率法、Pearsonx2检验、两独立样本t检验、Logistic分析、Kaplan-Meier分析Log-Rank检验、Cox风险比例模型分析等统计学方法,比较两组间造血重建时间,移植后100d急性心力衰竭、肝静脉闭塞病(HVOD)、急性移植物抗宿主病(aGVHD)、出血性膀胱炎、病原体(细菌、真菌及病毒)感染事件等移植相关早期并发症,以及早期移植相关死亡(TRM)、慢性移植物抗宿主病(cGVHD)和远期总生存(OS)等。研究结果：①在造血重建方面,伊马替尼组平均粒系重建时间较对照组提前1.2d,平均巨核系重建时间较对照组提前1.9d,但两组间造血重建时间均无显著性差异(P>0.05)。②在移植相关早期并发症方面,伊马替尼组与对照组的aGVHD发生率(55.6%VS48.6%P=0.65)、HVOD发生率(7.4%VS3.8%P=0.60)、出血性膀胱炎发生率(22.2%VS27.1%P=0.80)、细菌感染事件发生率(22.2%VS7.8%P=0.18)、真菌感染事件发生率(11.1%VS5.1%P=0.37)、病毒感染事件发生率(11.1%VS20.0%P=0.38)均无统计学差异。然而,伊马替尼组急性心力衰竭发生率较对照组明显增高(29.6%VS8.6%,P=0.02)。但运用Logistic多因素分析CML异基因移植患者移植早期急性心力衰竭危险因素,则排除了伊马替尼的影响,表明去T淋巴细胞移植方案是急性心力衰竭的独立危险因素。③移植后随访100d,比较两组间TRM发生情况,两组间TRM具有明显统计学差异(22.2%VS2.9%P=0.001),Cox多因素分析则表明伊马替尼治疗及年龄偏大是早期移植相关死亡的独立危险因素,HR值分别是19.344和1.130。④cGVHD方面,两组间10年cGVHD累计发生率无明显统计学差异(22.2%VS28.6%P=0.72)。⑤OS方面,两组间十年累计OS率也无明显统计学差异(90.5%VS97.1%P=0.17)。研究结论：移植前应用伊马替尼治疗对CML异基因移植患者造血重建和移植后100d急性心力衰竭、aGVHD、HVOD出血性膀胱炎、细菌感染事件、真菌感染事件及病毒感染事件等移植相关早期并发症无明显影响。伊马替尼治疗一定程度上会增加移植后100d TRM,特别是在年龄偏大的患者中会增加早期死亡的风险。然而,伊马替尼治疗不会影响患者cGVHD及OS。