白三叶TrSAMDC1基因克隆及功能初探

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S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosyl-L-methionine decarboxylase,SAMDC)是多胺合成途径的关键酶之一,已被证实在调节植物生长发育和抵御逆境胁迫中发挥着重要作用。本试验通过同源克隆和RACE(Rapid-amplification of c DNA ends)技术首次获得一个白三叶(Trifolium repens)S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因,并命名为TrSAMDC1。运用一系列在线生物信息学软件对TrSAMDC1氨基酸序列和蛋白理化性质进行了分析,并使用实时荧光定量的方法分析了非生物胁迫、激素处理、信号物质处理下TrSAMDC1在白三叶叶片和根系中的表达,最后通过构建过表达载体和农杆菌介导法成功将TrSAMDC1转入到拟南芥中获得了转基因株系,主要得到了以下结果:(1)生物信息学分析表明,白三叶S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因全长为1559 bp,开放阅读框长度为1077 bp,编码358个氨基酸;预测其编码的蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽;蛋白质二级结构由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角构成,三级结构为二聚体结构;TrSAMDC1编码的多肽链上含有多个磷酸化位点,在其多肽链5-331 bp的区域存在S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶家族所特有的S-腺苷甲硫氨酸脱羧基作用的保守结构域(SAM-decarbox结构域)、酶原剪切位点结构域(LSESSLF)和“PEST”(TIHITPEDGFSYASFE)结构域。此外还存在参与S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶与底物结合和催化自身酶活性过程的高度保守的氨基酸位点:谷氨酸(Glu7、Glu10)、半胱氨酸(Cys50、Cys83、Cys229)、丝氨酸(Ser55、Ser232)和组氨酸(His245);系统进化树和多序列比对表明TrSAMDC1与其他豆科植物尤其是红三叶序列相似性很高、亲缘关系很近,在进化上高度保守。(2)运用实时荧光定量对TrSAMDC1的表达模式分析发现,本试验所有处理都能显著上调TrSAMDC1在叶片中的相对表达量,随着胁迫时间的变化,表达量也发生变化。而根系表达量虽较对照有差异,但对各种处理的敏感程度显著低于叶片。在干旱(PEG)、盐(Na Cl)、高温(Heat)、低温(Cold)和重金属镉(Cd SO4)等5种非生物胁迫下,叶片表达量在处理1.5 h显著上升,峰值均出现在处理6 h以后,并且在PEG和Heat处理下的表达量最高,分别为对照的7.85和13.5倍。Cold处理下最低,为对照的3.0倍;在信号物质处理下,虽然叶片表达量在1.5 h显著上升,但在处理24 h后才达到了峰值。叶片中TrSAMDC1的表达在过氧化氢(H2O2)处理下最高,根系中TrSAMDC1的表达在亚硝基铁氰化钠(SNP)处理下最高,而氯化钙(Ca Cl2)处理下TrSAMDC1在根系和叶片中的表达都很低;在三种激素处理下,TrSAMDC1的表达在叶片中更高。脱落酸(ABA)处理下1.5 h时根系表达量上升为对照的2倍,随后开始受到抑制。而叶片中的表达在1.5 h时受到抑制,随后表达量显著上调。生长素(IAA)处理下,根系表达量虽在1.5 h显著上升,达到峰值,但总体来说表达量低于根系。精胺(Spm)处理的每个时间段叶片TrSAMDC1的表达水平都在对照的3倍以上,并且在三种激素处理中,TrSAMDC1对Spm的响应更加快速,表达水平更高。(3)自然干旱和300 mmol/L盐胁迫下,转基因植株萎蔫程度显著低于野生型,表明TrSAMDC1过表达缓解了胁迫造成的损伤,并且TrSAMDC1过表达显著提高了转基因植株在干旱胁迫下的保水能力、最大光能转化效率(Fv/Fm)和盐胁迫下的鲜干重,并显著降低了转基因植株在两种胁迫下的丙二醛含量,提高了抗氧化酶活性。说明TrSAMDC1在转基因植株抵抗干旱胁迫和盐胁迫的过程中发挥重要作用。此外,TrSAMDC1过表达显著提高正常条件下和干旱胁迫下转基因植株的腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)水平,但在正常条件下转基因与野生型没有表型上的差异。
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