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天然免疫系统通过模式识别受体,包括Toll样受体(TLRs)、RIG-I样受体(RLRs)和DNA受体等,识别入侵机体的病原微生物模式相关分子(pathogen-associated molecular pattern, PAMP),经过一系列信号转导,进而启动天然免疫反应。识别PAMP后,这些受体进而活化共同的下游通路激活转录因子包括转录因子NF-κB和IRFs (interferon regulatory factors),进而产生炎性细胞因子以及I型干扰素,进而诱导随后的适应性免疫应答。I型干扰素与其受体相互作用,活化JAK (Janus kinase)和STAT (Signal transducers and activators of transcription)信号通路,诱导IFN-stimulated genes (ISGs)的表达,这些ISGs协同作用,激活机体的抗病毒反应。尽管,I型干扰素在机体的清除病毒反应中起着非常重要的作用,但是异常的I型干扰素的产生,会引发各种相关免疫疾病。因此,严格的调控I型干扰素对于维持机体的免疫稳态是非常重要的。去泛素化酶(DUBs)能够从靶蛋白上切除泛素分子或者泛素样分子。已有研究表明,一些DUBs参与调控I型干扰素通路。类如A20、DUBA、泛素特异性蛋白酶17(USP17)、USP4以及USP3等分子通过不同的作用机制调控I型干扰素通路。USP2属于泛素特异性蛋白酶家族,由于剪接方式不同,产生3个剪接体USP2a、USP2b和USP2c。有研究表明USP2a通过靶向TRAF6负向调控IL-1β和病毒诱导的NF-κB活化,然而USP2在I型干扰素通路以及机体抗病毒反应中的作用仍然未知。因此,本研究从以下几个方面进行。研究目的:1.USP2是否参与调控I型干扰素通路,那个剪接体会发挥作用。2.探讨USP2调控I型干扰素通路的作用机制。3.USP2是否参与调控其他的天然免疫信号通路。研究方法:1.病毒SeV诱导的I型干扰素通路中,USP2表达情况SeV感染HEK293或THP1细胞不同时间点,Western blot检测USP2蛋白表达。2.USP2调控病毒诱导的I型干扰素IFN-β的表达2.1报告基因方法检测USP2对IFN-β报告基因活化的影响HEK293细胞转染不同梯度USP2a、USP2b和USP2c表达质粒以及IFN-β-luc报告基因质粒20h后,SeV刺激8h,报告基因检测IFN-β-luc的活化。HEK293细胞转染USP2干扰RNA以及IFN-β-luc报告基因质粒48h后,SeV刺激8h,报告基因检测IFN-β-luc的活化。2.2PCR扩增检测USP2对IFN-β基因表达的调控HEK293细胞转染USP2a、USP2b和USP2c表达质粒20h后,SeV刺激8h,PCR检测IFN-β基因表达。HEK293或THP1细胞转染USP2干扰RNA48h后,SeV刺激8h,PCR检测IFN-β基因表达。3.USP2调控I型干扰素通路的作用机制3.1确定USP2作用的靶分子将RLRs信号通路中的接头分子RIG-I, MDA5, MAVS, TBK1和IRF3-5D以及USP2b质粒共转染到HEK293细胞中,24h后,PCR检测IFN-β基因表达。HEK293细胞转染接头分子RIG-I, MDA5, MAVS, TBK1和IRF3-5D以及USP2b质粒和IFN-β-luc报告基因质粒24h后,报告基因检测IFN-β-luc的活化。3.2USP2b与靶分子TBK1(TANK-binding kinase1)的相互作用HEK293细胞转染Flag-USP2b以及HA-TBK1,使用Flag标签抗体做免疫共沉淀(IP),使用标签抗体HA,检测USP2b与TBK1之间的相互作用。THP1细胞用SeV刺激不同时间点,使用USP2抗体做IP, Western blot检测内源USP2b与TBK1的相互作用。3.3USP2b对TBK1的K63位点泛素化影响HEK293细胞转染Flag-USP2b或者USP2干扰RNA,以及Myc-TBK1、HA-Ub,使用Myc标签抗体做IP, Western blot检测TBK1的泛素化水平。HEK293细胞转染Flag-USP2b和Myc-TBK1以及HA-Ub (K48)或者HA-Ub (K63),使用Myc标签抗体做IP,Western blot检测TBK1的泛素化水平。HEK293细胞转染Myc-TBK1, HA-Ub和Flag-USP2b或者USP2bC67A,使用Myc标签抗体做IP, Western blot检测TBK1的泛素化水平。3.4USP2b对TBK1激酶活性的影响HEK293细胞转染Flag-USP2b表达质粒或者USP2干扰RNA, SeV刺激6h,使用TBK1抗体做IP,检测TBK1激酶活性。4. USP2b的抗病毒作用HEK293细胞转染Contrl质粒、USP2b或者USP2b C67A,24h后进一步转染poly(I:C)或者PBS,8h后,VSV感染24后,收集培养细胞的上清(含VSV),剩余细胞提取RNA,上清做空斑试验,检测病毒滴度;RNA反转录成cDNA, real-time PCR检测细胞内VSV RNA复制。HEK293或THP1细胞转染对照或者USP2干扰RNA,方法同上,分别检测病毒滴度以及VSV RNA复制。5. USP2b在其他天然免疫信号通路中的作用HEK293细胞转染USP2b质粒或者干扰RNA,同时转染TRIF, cGAS加STING和IFN-β-luc报告基因质粒,报告基因检测IFN-β-luc的活化。THP1细胞转染对照或者USP2干扰RNA48h,分别用LPS、poly(I:C)刺激或者转染ISD12h, PCR检测IFN-β基因表达。研究结果:1.SeV感染HEK293或THP1细胞后,USP2表达下调2. USP2b负向调控病毒诱导的I型干扰素IFN-β的表达。2.1过表达USP2b抑制SeV诱导的IFN-β-luc的活性2.2过表达USP2b抑制SeV诱导的IFN-β基因的表达2.3过表达USP2b抑制SeV诱导的IRF3-luc的活性2.4USP2b的点突变C67A不能抑制SeV诱导的IFN-β-luc以及IFN-β基因表达。3.干扰掉USP2b后,增强IFN-β的表达3.1USP2b的特异性siRNA可以干扰掉USP2b的表达(mRNA和蛋白水平)。3.2干扰掉USP2b后,SeV诱导的IFN-β-luc活性以及IFN-β基因都增加。4. USP2b靶向TBK1USP2b抑制RLRs信号通路中的接头分子RIG-I, MDA5, MAVS,TBK1活化的IFN-β-luc和IFN-β基因,而对IRF3-5D活化的IFN-β-luc和IFN-p基因表达没有影响。5. USP2b能够对TBK1的K63位去泛素化5.1USP2b与TBK1相互作用。5.2过表达USP2b降低TBK1泛素化水平,USP2b的点突变C67A则不能降低BK1泛素化。相反,干扰掉USP2b后,TBK1的泛素化水平增加。作为对照,USP2b对RIG-I和MAVS的泛素化水平没有影响。5.3过表达USP2b能够减少TBKl的K63位泛素化水平。6. USP2b消弱TBK1激酶活性过表达USP2b消弱SeV诱导的TBK1激酶活性,相反,干扰掉USP2b后,SeV诱导的TBK1激酶活性增加。7. USP2b负调细胞的抗病毒反应过表达USP2b后,VSV病毒滴度以及VSV的RNA复制增加,相反,干扰掉USP2b后,VSV病毒滴度以及VSV的RNA受到抑制。8. USP2b负调TLR3/4和DNA诱导的I型干扰素信号通路过表达USP2b抑制TRIF(TLR3通路)以及cGAS加STING (DN A通路)诱导的IFN-p-luc活性,相反,干扰掉USP2b后,IFN-β-luc活性增加。THP1细胞中,干扰掉USP2b后,LPS (TLR4配体)、poly(I:C)(TLR3配体)以及ISD (DNA受体活化剂)刺激的IFN-β基因表达增加。结论:1.SeV刺激后,USP2b表达下调,USP2b负向调控病毒诱导的I型干扰素通路。2. USP2b靶向TBK1,通过与TBK1相互作用,对TBK1进行K63位去泛素化。3. USP2b负向调控细胞的抗病毒反应。4. USP2b负调TLR3/4和DNA诱导其他天然免疫信号通路。创新点和意义:1.本研究首次证明USP2b可以负向调控IFN-β的产生及细胞的抗病毒反应。研究发现USP2b负向调控IFN-β的产生的机制是通过与关键激酶TBK1相互作用,进而去其进行K63位的去泛素化,从而抑制TBK1的活性。2.由于TBK1作为病毒(包括RLRs,TLR3和DNA受体)诱导I型干扰素产生的关键激酶,USP2b可以广泛参与调控I型干扰素的表达及抗病毒反应。3.本研究为负向调控I型干扰素产生提供新的实验证据,USP2b可以作为研发药物的靶点来控制病毒感染引发的过度固有免疫反应。