近年来,单分子检测技术以高灵敏度、高选择性引起人们的广泛关注。其中以α-溶血素(α-HL)蛋白质纳米孔/纳米通道为传感元件的生物纳米孔检测技术已经广泛应用于随机传感各种分析物,如金属离子、有机分子、多肽、DNA/RNA和蛋白质等。该技术利用待测分子穿过纳米孔时引起电流的变化实现对目标分析物的检测,通过对特征信号(滞留时间和电流阻塞振幅)的分析达到定性、定量的目的。如果被分析物的尺寸太小,引起的电流变化不易被检测到,则可通过在纳米孔内修饰适配体分子,从而增强对分析物的响应。环糊精分子因其大小与α-HL通道尺寸匹配,常作为适配体分子以非共价键结合在纳米通道内,利用环糊精和小分子的相互作用可实现对分析物的检测。本论文系统研究了全(6-脱氧-6-氨基)-β-环糊精(即am7βCD)分子和不同突变体蛋白质纳米孔的相互作用,筛选出与am7βCD具有强相互作用的蛋白,该研究对以am7βCD为适配体分子的纳米孔单分子技术检测小分子具有重要意义。另外,通过蛋白质筛选,电解质溶液pH以及跨膜电压的优化,首次将电荷相反的两个环糊精同时组装在纳米孔内,在通道中形成了一个独特的纳米空腔,该空腔为后续有机小分子的识别和检测提供了可能。主要研究结果如下:1.单环糊精与蛋白质纳米孔的相互作用实验主要从三个方面考察了 am7βCD分子与蛋白质纳米孔之间的相互作用。首先,设计了三种突变蛋白(K147N/M113F)7、(M113F)7以及(K8A/M113R)7,研究突变位点以及突变残基对二者作用的影响。结果表明,113位氨基酸的突变对于二者的结合影响很大,且突变为苯丙氨酸后对环糊精分子的键合能力更强。对比(K147N/M113F)7与(M113F)7两种蛋白质发现147位氨基酸的突变增大了环糊精分子进入纳米孔的频率。其次,研究不同电压下环糊精与(K147N/M113F)7蛋白质纳米孔的相互作用。实验结果表明,am7βCD在Trans端只有在正电压下才能与蛋白质纳米孔作用。而在Cis端只有在负电压下才能与蛋白质纳米孔键合。并且随着电压的增大,环糊精分子与蛋白质纳米孔的键合时间越长。最后,研究了不同pH的电解质溶液下am7βCD分子与(K147N/M113F)7蛋白质纳米孔的相互作用。结果表明,随着电解质溶液pH的增大,am7βCD分子与蛋白质纳米孔的作用明显增强。2.双环糊精在蛋白质纳米孔内的组装实验中制备了野生型(WT7)以及突变体(K147N/M113F)7和(K8A/M113R)7三种不同的蛋白质纳米孔。将带正电荷的am7βCD以及带负电荷的全(2,3-乙酰基-6-磺酸基)-β-环糊精(HDAS-PCD)分子分别加在纳米通道的两端并检测电流信号,从中筛选出能够同时与两种环糊精相作用的蛋白。研究结果表明,WT7和(K147N/M113F)7只对am7βCD分子有响应,与HDAS-PCD分子不作用。而(K8A/M113R)7蛋白质纳米孔对两种环糊精分子皆有良好的响应,并且出现了两种环糊精同时组装在纳米通道中的电流信号,该电流阻塞程度比单个环糊精进入蛋白质纳米通道中产生的电流阻塞大。实验考察了跨膜电压以及电解质溶液pH对双环糊精分子在蛋白纳米通道中组装的影响。结果表明:随着电压的增大,双环糊精分子与纳米通道的键合时间变长。+160 mV时,键合时间为36.48 ms,约为+100mV时的7倍。双环糊精分子与纳米通道的键合时间随电解质溶液pH的不断增大而减小。pH为5.5和11.5时,键合时间分别为90.47 ms和0.76 ms。通过优化电解质溶液pH以及跨膜电压,可以获得电流阻塞程度适宜、滞留时间长的双环糊精阻塞信号。组装在纳米孔内的电荷相反的两个环糊精,形成了一个独特的纳米空腔,该空腔为后续有机小分子的识别和检测提供了可能。