细菌感染作为临床上最常见的疾病,严重威胁着人们的生命健康,若治疗不及时或不当,病死率甚高。随着抗菌药物的不断开发,抗菌治疗已经取得了长足的进展。然而,由于抗生素治疗缺乏特异性、较低的生物利用度和严重的副作用等特点限制了其在临床上的治疗效率。在细菌感染的过程中,会分泌大量的毒素,这些毒素可作为细菌保护自身的武器。成孔毒素作为一类最常见的毒素蛋白,在致病菌感染过程中,发挥着重要作用。其不仅可以通过破坏组织细胞为细菌繁殖提供营养,同时影响中性粒细胞或巨噬细胞对细菌的清除作用,造成对宿主机体持续不断的损害。因此,在细菌感染的治疗过程中,若卸下细菌的这些武器,对减轻组织损伤、加速细菌清除将具有重要意义。基于成孔毒素和动物细胞膜之间的成孔原理,本课题拟设计一种广谱纳米“解毒剂”,即一种由人体细胞自身含有的脂质成分组成的脂质体CSPL,作为毒素诱饵和抗菌药物载体,来高效中和成孔毒素,并且实现抗菌的目的。首先,作为极具吸引力的诱饵,CSPL可以通过与宿主细胞之间竞争结合成孔毒素,将其隔离在脂质体的磷脂双分子层中,从而避免与宿主细胞结合造成细胞的破裂和炎症的发生,同时解除成孔毒素对机体免疫反应的干扰作用,恢复免疫细胞对细菌的清除能力。其次选用一线抗菌药万古霉素(Van),将其包封在CSPL的亲水相内核中,得到Van@CSPL。当Van@CSPL达到感染部位时,脂质体本身会吸附大量细菌分泌的成孔毒素,同时成孔毒素在脂质体膜上打孔,使得万古霉素被大量释放,从而发挥有效的抗菌作用。通过此方式,这种解毒/释药智能型一体化平台将抗生素特异性释放在细菌感染部位,不仅可以减少抗生素的用量,同时减轻抗生素的毒副作用。通过薄膜分散法,本课题成功制备了由胆固醇、鞘磷脂和卵磷脂组成的脂质体-CSPL,其摩尔比为4:1:1。DLS测得其平均粒径为148.5 nm,且在生理条件下具有良好的分散性。透射电镜图(TEM)表明,制备的CSPL呈类球型结构,且粒径大小相对均一。除此之外,作为对照,本课题还制备了另外两种脂质体-CSL2、CSL1,其由胆固醇和鞘磷脂组成,摩尔比分别为2:1、1:1。最后,我们制备了 Van@CSPL,并以罗丹明B(RB)代替万古霉素,对其进行释药行为的考察。释药实验中,RB@CSPL中RB的累积释放量在加入α-毒素后呈现明显上升的趋势,表明α-毒素可以通过在CSPL脂质体膜上打孔导致水相内核中RB的释放,推断出α-毒素可导致Van@CSPL中万古霉素的释放,从而发挥直接的抗菌作用。以α-毒素为成孔毒素蛋白模型,通过溶血实验测定CSPL的解毒能力。实验结果表明,与CSL2和CSL1两种脂质体相比,我们所构建的纳米解毒剂CSPL具有显著的抗溶血能力。通过NTA对CSPL中和α-毒素进行定量分析,计算得出一个CSPL脂质体分子大概可以吸附1.98×104个毒素蛋白。以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为细胞模型,通过抑制率实验考察了脂质体CSPL对毒素的隔离能力。结果表明,在加入不同浓度α-毒素的各组中,CSPL均表现出高效中和α-毒素的能力,明显好于CSL2和CSL1。共聚焦显微镜结果显示,传统脂质体(CL)不具有与α-毒素结合的能力,随着毒素剂量的增加,导致细胞膜结构被破坏。而相比之下,CSPL可以有效地隔离α-毒素,并阻止其通过在细胞膜上打孔破坏细胞的结构,从而保证了 HUVECs能通过正常的类似包吞作用的方式将脂质体摄入细胞内。以感染金黄色葡萄球菌的昆明小鼠为动物模型,对CSPL和Van@CSPL进行体内抗菌能力的考察。活体成像结果表明,CSPL最终富集于肝脏,因此可经肝脏代谢,从而避免毒素在代谢过程中对其他器官造成损伤。抗金黄色葡萄球菌败血症感染实验结果表明,与其他治疗组相比,CSPL组小鼠存活率明显提高,小鼠体内与炎症相关的肿瘤坏死因子(TNF-α水平明显降低,并且CSPL能有效降低感染小鼠体内细菌载量。除此之外,在与万古霉素的联合治疗过程中,Van@CSPL治疗组小鼠的存活率在第6天依然维持在70%。在金黄色葡萄球菌肺炎的治疗过程中,CSPL能明显降低肺中肿瘤坏死因子水平,并且能极大降低小鼠肺中和血液中的细菌载量,提高了小鼠的存活率。在Van@CSPL治疗作用下,感染小鼠存活率进一步明显提高。H&E结果显示,Van@CSPL治疗组小鼠肺部炎症病变明显减轻。本课题结合成孔毒素毒理机制及脂质体结构特征,制备与毒素具有高度亲和力的新型脂质体,采用“以柔克刚”的策略,卸下细菌攻击细胞的武器,减少抗生素的用量,增强治疗效率。同时以万古霉素为模型药物,将其包载在解毒剂脂质体水溶性内核中,借助于成孔毒素在脂质体上形成的孔道,实现万古霉素在感染部位快速释放,形成解毒、释药空间一体化的纳米解毒系统。这种安全高效能的CSPL为治疗细菌感染提供了一种新思路。