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白血病是一种严重危害人类健康的常见病和多发病。目前，其治疗仍主要依赖大剂量的化学治疗药物和骨髓移植，但疗效不甚理想且容易复发，因此白血病的分子发病机制和基因治疗措施就成为新的研究热点。自2000年国外学者发现和报道了新的促凋亡基因Smac/DIABLO以来，将其成功用于恶性肿瘤(实体瘤)及某些白血病的体外实验研究的报道就越来越多，为提出恶性肿瘤以及白血病新的化疗方案和研究开发新的基因工程药物提供了新思路和依据。目的：本研究以人类白血病细胞株Jurkat、K562和U937为实验模型，在细胞和分子水平上研究促凋亡基因Smac/DIABLO诱导白血病细胞株细胞凋亡及其可能机制，通过对Smac/DIABLO这一促凋亡基因及其所表达的蛋白质的研究，来为临床上恶性肿瘤的治疗方案提供新选择。方法：主要通过从Jurkat细胞内提取Smac/DIABLO总RNA，进而获得mRNA，再通过RT–PCR获得Smac/DIABLO的dscDNA。然后再将Smac的基因片段装入表达载体pcDNA3.1/His A组成重组子。再将该重组子转染K562和U937细胞，观察肿瘤细胞的生长及凋亡情况，并采用免疫细胞化学ICH、光学显微镜LM和流式细胞仪FCM进行检测分析。 <WP=8>1.构建含有Smac/DIABLO基因片断的重组质粒pcDNA3.1 /HisA-Smac/DIABLO。(1).Smac mRNA的获得。从Jurkat细胞中提取Smac/DIABLO基因的总RNA，进而用层析法得到Smac mRNA。(2).Smac/DIABLO全长cDNA的获得。以Smac/DIABLO mRNA 为模板，根据Smac/DIABLO基因在GeneBankTM中的参考序列和pcDNA3.1/His A的多克隆位点，设计带有XhoI/BamHI的引物，通过两步法RT-PCR获得该基因的全长dscDNA。(3).重组质粒的构建。用限制性内切酶XhoI/BamHI对Smac/DIABLO dscDNA和质粒pcDNA3.1/His A进行双酶切，将纯化回收的DNA和质粒的目的片断用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态进行质粒的扩增和提取。从转化平板上挑单菌落以pcDNAR/T7 promoter为引物进行PCR扩增，检测插入的DNA片断的大小。同时，对扩增的重组质粒测序。2.重组质粒短暂转染白血病细胞株。用阳离子脂质体Geneporter去瞬时转染 K562细胞和U937细胞，培养24小时后进行细胞涂片。5.凋亡的观察和检测。对转染细胞用Annexin V法进行分析，检测凋亡情况。同时，对细胞内的caspase﹣3以及野生型的Smac蛋白的表达情况进行免疫细胞化学染色分析，借助流式细胞仪FCM、光学显微镜LM、免疫细胞化学IHC等方法来检测凋亡的发生。 <WP=9>结果： 1.重组质粒pcDNA3.1/His A-Smac/DIABLO的成功构建。经检测插入的DNA片断的序列与Smac/DIABLO dsCDNA酶切后的片断大小相同，测序结果与GeneBankTM中的参考序列完全一致，证明已经成功构建重组真核表达载体。2.组化结果显示：在K562和U937细胞中，Smac/DIABLO蛋白的表达在转染后明显高于转染前；在转染后48-72hr凋亡相关蛋白caspase-3的表达增加。3.转染后48-72小时，Smac/DIABLO蛋白的过表达诱导白血病细胞凋亡。K562细胞和U937细胞在光镜及免疫细胞化学中表现出现凋亡的特点。结论：本实验研究了Smac/DIABLO这一新的促凋亡基因诱导白血病细胞凋亡的现象，并在分子水平上对诱导凋亡的机理做了初步探讨，为进一步进行白血病的新的化疗方案提供体外实验的依据，仍需体内实验的支持和深入研究。