目的:舌鳞状细胞癌(Tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是最常见的口腔癌,尽管不断的改进治疗策略,这种疾病仍缺乏有效的治疗方法,具有较高的发病率和死亡率。干扰素-β(Interferon-β,IFN-β)因能抑制多种肿瘤细胞的生长,而成为肿瘤基因治疗研究的热点之一,然而由于重组IFN-β生物半衰期短,最大耐受剂量的IFN-β系统给药难以达到消除肿瘤的有效浓度,限制其在体内的应用。研究表明,应用表达IFN-β的腺病毒对膀胱癌及肺癌等有治疗作用,然而以病毒为表达载体的基因治疗由于载体安全性、诱导器官毒性以及难以有效的到达肿瘤转移部位等尚未能用于临床治疗。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)有望成为更安全、更有效的抗肿瘤基因释放的载体,系统应用IFN-β修饰的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)能够成功的迁移至肿瘤部位,并抑制肿瘤的生长。然而,研究表明BMSCs本身能够促进TSCC细胞的增殖和迁移,并促进TSCC的生长,而不宜作为TSCC治疗的靶向载体。近期有学者提出人牙龈间充质干细胞(gingiva-derived mesenchymal stem cells,GMSCs)能够抑制口腔鳞癌细胞的生长增殖,GMSCs无体内成瘤性,其来源于健康牙龈组织,牙龈组织从口腔内取材容易,创伤小,上述研究提示GMSCs可以作为IFN-β肿瘤靶向基因治疗的良好载体。因此本课题旨通过体内外实验探讨IFN-β修饰的人GMSCs对TSCC的生物学效应及作用机制,为临床治疗TSCC提供新思路。本实验分离培养人GMSCs,构建表达IFN-β的慢病毒载体及空载载体,分别转染人GMSCs得到GMSCs/IFN-β、GMSCs/vector,检测 GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β及IFN-β在体外对TSCC细胞生物学活性的影响,并探讨其作用机制;使用裸鼠TSCC移植瘤模型来检测GMSCs/IFN-β是否能够选择性的迁移至肿瘤组织内,并作为IFN-β释放的载体发挥抑制TSCC生长的效应。材料与方法:1.有限稀释法克隆培养人GMSCs及其多向分化能力的检测牙龈标本取自进行牙冠延长术的健康牙龈组织,通过有限稀释法分离培养人GMSCs,并检测人GMSCs克隆形成能力、群体倍增值,流式细胞仪检测其细胞表面干细胞标志物的表达。为检测人GMSCs向成骨方向分化的能力,将GMSCs分别接种于6孔板和24孔板中,加入成骨诱导液进行培养,基础培养液为含10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的细胞培养液(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM),诱导剂为50mg/L的维生素C、O.1μmol/L的地塞米松、10mmol/L的β-磷酸甘油钠,培养28天(days,d)以后,在24孔板中进行茜素红染液染色。为检测GMSCs向成脂方向分化的能力,将GMSCs分别接种于6孔板和24孔板中,加入成脂诱导液进行培养(基础培养液为含10%FBS的DMEM,诱导剂为2mmol/L胰岛素,0.5mmol/L异丁基-甲基黄嘌呤,0.5μmol/L皮质醇,60μmol/L吲哚噪美辛),在24孔板中进行油红O染液染色。为检测GMSCs向成软骨分化的能力,将GMSCs置于离心管中,4℃下离心制备细胞团,将细胞团加入成软骨诱导液进行培养(基础培养液为无血清的DMEM,0.1μmol/L的地塞米松,50μg/ml的维生素C,lmmol/L丙酮酸钠,40μg/mlL-脯氨酸,10ng/ml转化生长因子-β3,6.25μg/mlITS)。培养28d以后,4%多聚甲醛固定过夜,将细胞团取出包埋、切片后,使用鼠抗人的Ⅱ型胶原蛋白抗体,进行免疫组织化学染色,含10%FBS的DMEM基础培养液为空白对照组。6孔板的细胞用磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline,PBS)冲洗 3 遍后使用 TRIzol 提取 RNA,进行实时定量聚合酶链反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测成骨、成脂及成软骨相关基因表达水平。2.IFN-β修饰的人GMSCs构建构建带有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记 的表达 IFN-β 的慢病 毒载体(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin-IFN-β)及空载体病毒(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin),分别转染人 GMSCs 得到GMSCs/IFN-β及GMSCs/vector,为检测携带IFN-β基因慢病毒的转染效率,转染一周后,通过 qRT-PCR 检测 GMSCs/IFN-β 及 GMSCs/vector 中 IFN-β 在 mRNA水平的表达;并收集转染一周后的条件培养基(Condition medium,CM),通过酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测 CM 中IFN-β蛋白的表达水平。3.GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β 及 IFN-β 对 TSCC 细胞的体外生物学效应3.1.CM的收集使用CM来检测GMSCs、GMSCs/vector及GMSCs/IFN-β对TSCC细胞系Ca127细胞生物学活性的影响。GMSCs、GMSCs/vector及GMSCs/IFN-β以新鲜培养液培养24小时(hours,h)后,收集培养液作为CM,基础培养基作为空白对照组(含10%FBS的DMEM),含750pg/ml IFN-β的基础培养基作为阳性对照组。3.2.CCK-8(Cell counting kit-8)法检测细胞增殖TSCC细胞系Ca127细胞以1× 103每孔的密度接入96孔板,接种细胞24h后按照设计的组别加入刺激,每天更换新鲜的刺激,于设计好的时间点每孔内加入1O0μl含10μl CCK-8的DMEM,培养箱内恒温孵育2h后,使用酶标仪检测450nnm处OD值。3.3.克隆形成实验Ca127细胞以1×103每孔的密度接入6孔板,接种细胞24h后按照设计的组别加入刺激,每天更换新鲜的刺激,7d后采用结晶紫染色法染色,40倍镜下计数形成克隆的数量,大于或等于50个细胞算一个克隆。3.4.流式细胞仪检测细胞周期Ca127细胞以2×105每孔的密度接入6孔板,接种细胞24h后按照设计的组别加入刺激,于37℃恒温培养箱培育2d,每天更换新鲜的刺激,按照说明书加入周期试剂后使用流式细胞仪检测细胞周期。3.5.流式细胞仪检测细胞凋亡Cal27细胞以2×105每孔的密度接入6孔板,接种细胞24h后按照设计的组别加入刺激,于37℃恒温培养箱培育3d,每天更换新鲜的刺激,按照说明书加入凋亡试剂后使用流式细胞仪检测细胞凋亡。3.6.细胞迁移实验使用多聚碳酸膜上有8μμm微孔的24孔Transwell细胞培养室来检测各组对Cal27细胞迁移能力的影响,细胞培养室上室接种1.5×105个Ca127细胞,细胞培养室的下室分别加入500μl各组CM、对照组培养基,将24孔Transwell细胞培养室放入37℃恒温培养箱内孵育24h,擦去小室滤膜上表面未迁移的细胞,固定后用结晶紫染色,显微镜下计数不同视野下迁移至小室滤膜下表面细胞的数量。3.7.细胞侵袭实验使用多聚碳酸膜上有8μm微孔的24孔Transwell细胞培养室上室内铺matrigel胶1h以模拟基底膜及基质,余下步骤同细胞迁移实验。3.8.Western blotting为检测GMSCs/IFN-β抑制Ca127细胞生长增殖的机制,我们使用western blotting检测AKT信号通路蛋白表达的变化。4.GMSCs、GMSCs/vector及GMSCs/IFN-β对裸鼠体内TSCC移植瘤的生物学效应42只雄性BALB/c裸小鼠(5周龄,体重为15-19g),购自北京维通利华实验动物技术有限公司,饲养于山东大学第二医院SPF级动物实验室,实验内容经医院伦理委员会批准。将Ca127细胞悬液密度调整为1×107/ml,接种于裸鼠右侧背部近腋窝处皮下,每只裸鼠接种Ca127细胞2×106个,当肿瘤的平均体积达到50mm3时,即达到了成瘤标准。随机取出2只裸鼠,完整分离出肿瘤组织后,进行H&E染色,在光学显微镜下观察组织切片,判断其是否符合TSCC的组织病理学特征,将其余40只裸鼠随机分为5组:(1)空白对照组:尾静脉注射200μ1 PBS;(2)GMSCs组:尾静脉注射含1×106个GMSCs的200μl PBS;(3)GMSCs/vector组:尾静脉注射含1×106个GMSCs/vector的200μlPBS;(4)GMSCs/IFN-β(intravenous,i.v.)组:尾静脉注射含1× 106个GMSCs/IFN-β的200μl PBS;(5)GMSCs/IFN-β(intratumoral,i.t.)组:肿瘤内注射含1×106个GMSCs/IFN-β的100μl PBS。按照以上方式每2周注射一次细胞悬液,共注射2次。每隔3d测量裸鼠肿瘤的长径及短径,计算肿瘤组织的体积并绘制肿瘤生长曲线;将裸鼠培养28d后,处死各组裸鼠,将分离出的肿瘤组织称重并记录;取裸鼠肿瘤组织做4μm厚度的冰冻切片,使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染细胞核后,在激光共聚焦显微镜下观察EGFP的表达情况;并将肿瘤组织制作石蜡切片,通过免疫组化染色检测肿瘤组织内IFN-β的表达,并检测与细胞增殖相关的核抗原Ki67在肿瘤组织中的表达。结果:1.分离培养的人GMSCs的生物学活性原代培养的人牙龈细胞呈成纤维细胞的形态特征,通过有限稀释法分离培养人GMSCs,经过14d培养后,通过克隆计数计算,人GMSCs的克隆形成率(colony formingunit-fibroblastic,CFU-F)为(21.4±2.8)%;人GMSCs传至12代时仍能表现出较高的生长活性,其群体倍增值为40.95±4.19:通过流式细胞仪检测,人GMSCs表达间充质源性干细胞表面标志物CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和Stro-1,不表达造血源性干细胞表面标志物CD14、CD34、CD45;人GMSCs经成骨诱导剂培养28d后,茜素红钙盐染色显示诱导组人GMSCs形成红色的矿化结节;人GMSCs经成脂诱导剂培养28d后,油红O染色显示诱导组人GMSCs细胞内出现密集红染的脂肪小滴;经成软骨诱导剂培养28d后,免疫组织化学染色显示诱导组人GMSCs细胞团Ⅱ型胶原染色阳性;在qRT-PCR实验中,经过诱导的GMSCs组成骨相关基因(RUNX2、OPN和BSP2)、成脂相关基因(leptin、adipsin和PPARy2)和成软骨相关基因(aggrecan、COL-Ⅱ和SOX9)mRNA表达水平显著高于未加诱导剂的正常对照组。2.构建的GMSCs/IFN-β能够稳定表达分泌IFN-β携带IFN-β的慢病毒及空载体病毒转染人GMSCs后,人GMSCs形态未发生明显变化,细胞呈长梭形,有成纤维细胞的形态特征;转染慢病毒48h后荧光显微镜下观察,GMSCs/vector组与GMSCs/IFN-β组均有较强的荧光表达;QRT-PCR结果显示GMSCs/IFN-β组IFN-β mRNA表达量显著高于GMSCs、GMSCs/vector组(P<0.01);ELISA结果显示GMSCs/IFN-β组IFN-β分泌量为756.7± 19.91pg/ml,显著高于GMSCs、GMSCs/vector组(P<0.01),表明GMSCs/IFN-β分泌的IFN-β蛋白水平与mRNA水平一致,而GMSCs与GMSCs/vector两组间IFN-β的表达无明显差异,实验结果证实GMSC/IFN-β能够稳定的表达分泌IFN-β。3.GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β及IFN-β在体外显著抑制Ca127细胞的生长增殖CCK8结果显示,与空白对照组相比,培养2d后,各实验组Ca127细胞生长增殖明显减慢(P<0.01);而GMSCs/vector组与GMSCs组相比,Ca127细胞生长活性无显著性差异;GMSCs/IFN-β组、IFN-β组,与GMSCs、GMSCs/vector组相比,表现出更显著的抑制Ca127细胞生长的效应(P<0.01);GMSCs/IFN-β组与IFN-β组对Ca127细胞生长增殖的抑制效应无明显差异。克隆形成实验得到类似的结果,与空白对照组相比,各实验组形成的克隆数目显著减少(P<0.01);而与GMSCs组相比,GMSCs/vector组Ca127细胞克隆形成数目无显著性差异;与GMSCs组、GMSCs/vector组相比,GMSCs/IFN-β及IFN-β表现出更显著的抑制Ca127细胞克隆形成能力的效应(P<0.01);GMSCs/IFN-β组与IFN-β组Ca127细胞克隆形成数目无明显差异。为检测GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β及IFN-β抑制Ca127细胞生长增殖的机制,我们使用流式细胞仪检测各组对细胞周期及凋亡的影响,结果显示,与空白对照组相比,各实验组对Ca127细胞的细胞周期无显著影响,各组Ca127细胞中S期细胞的所占的比例统计学差异;与空白对照组相比,各实验组均显著促进Ca127细胞凋亡(P<0.01);与GMSCs组、GMSCs/vector组相比,GMSCs/IFN-β及IFN-β表现出更显著的促进Ca127细胞凋亡的效应(P<0.01),结果证实GMSCs/IFN-β在体外显著抑制Cal27细胞的生长增殖并促进其凋亡。Western blotting结果显示,GMSCs/IFN-β作用后,Ca127细胞中AKT的磷酸化水平显著下降,提示GMSCs/IFN-β抑制Ca127细胞的生长增殖,可能与AKT信号通路的下调有关。4.GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β及IFN-β在体外显著抑制Ca127细胞的迁移及侵袭与空白对照组相比,GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β及IFN-β组Ca127细胞迁移至Transwell小室膜下方的细胞数量显著减少(P<0.01);而与GMSCs组相比,GMSCs/vector组Ca127细胞迁移到小室下表面的数量无显著性差异;与GMSCs、GMSCs/vector组相比,GMSCs/IFN-β及IFN-β表现出更显著的抑制Ca127细胞迁移的效应(P<0.01);GMSCs/IFN-β组与IFN-β组Ca127细胞迁移到小室下表面的数目无明显差异。细胞侵袭实验得到类似的结果,结果显示GMSCs/IFN-β具有显著抑制Ca127迁移和侵袭的效应。5.GMSCs、GMSCs/vector及GMSCs/IFN-β在体内显著抑制裸鼠TSCC移植瘤的生长5.1.外源性 GMSCs、GMSCs/vector 及 GMSCs//IFN-β 向 TSCC 移植瘤组织迁移肿瘤组织H&E染色结果显示,本部分实验成功建立裸鼠TSCC移植瘤模型,裸鼠生长良好;制作裸鼠移植瘤组织冰冻切片后,在激光共聚焦显微镜下观察,结果显示尾静脉注射GMSCs/vector组、GMSCs/IFN-β(i.v.)及GMSCs/IFN-β(i.t.)组TSCC组织内均可见绿色荧光表达,GMSCs组细胞未经EGFP标记,因此和空白对照组TSCC组织内未见绿色荧光表达;免疫组化染色显示GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β(i.v.)及GMSCs/IFN-β(i.t.)组的肿瘤组织内均可见IFN-β的表达,而在空白对照组肿瘤组织内未见IFN-β的表达,与体外结果相一致,GMSCs/IFN-β(i.v.)及GMSCs/IFN-β(i.t.)组IFN-β阳性表达的细胞数量显著高于GMSCs、GMSCs/vector组(P<0.01),说明经尾静脉注射后GMSCs/IFN-β向肿瘤组织迁移定植并分泌IFN-β。5.2.GMSCs、GMSCs/vector及GMSCs/IFN-β抑制TSCC移植瘤的生长与空白对照组相比,各实验组裸鼠肿瘤组织的体积生长显著减慢(P<0.01);与GMSCs、GMSCs/vector组相比,GMSCs/IFN-β(i.v.)、GMSCs/IFN-β(i.t.)组裸鼠肿瘤组织的体积显著减小(P<0.05);GMSCs组与GMSCs/vector组两组间肿瘤组织体积曲线无显著性差异,说明病毒转染对GMSCs的生物学特性无明显影响;GMSCs/IFN-β(i.v.)显示出比其他各组更为显著的抑制肿瘤生长的效应(P<0.05),此结果与各组IFN-β表达量相一致,提示GMSCs/IFN-β在肿瘤组织局部分泌释放的IFN-β可能发挥抑制TSCC生长的效应;免疫组化染色结果显示,各实验组裸鼠肿瘤组织内Ki67阳性染色的细胞数目较空白对照组显著减小(P<0.05),而与GMSCs、GMSCs/vector组相比,GMSCs/IFN-β(i.v.)、GMSCs/IFN-β(i.t.)两组裸鼠肿瘤组织内Ki67阳性染色的细胞数目显著减少(P<0.05),并且,GMSCs/IFN-β(i.v.)组肿瘤组织内Ki67阳性染色的细胞数目显著少于GMSCs/IFN-β(i.t.)组(P<0.05),提示各实验组抑制TSCC生长的效应可能与抑制肿瘤细胞增殖有关。结论:1.通过有限稀释法成功从人牙龈组织中分离培养出GMSCs。2.成功构建IFN-β修饰的人GMSCs(GMSCs/IFN-β),GMSCs/IFN-β能稳定表达分泌IFN-β。3.人GMSCs能够抑制TSCC细胞系Ca127细胞的生长增殖、迁移及侵袭,促进其凋亡,反映出GMSCs作为IFN-β释放载体对TSCC治疗的有效性和安全性。4.与GMSCs相比,GMSCs/IFN-β能够更显著地抑制TSCC细胞生长增殖、促进凋亡、抑制其侵袭和迁移,Western blotting结果提示GMSCs/IFN-β抑制Ca127细胞的生长增殖效应,可能与AKT信号通路的下调有关。5.尾静脉注射的GMSCs、GMSCs/vector及GMSCs/IFN-β能够向裸鼠TSCC移植瘤组织迁移并在体内抑制肿瘤组织的生长,GMSCs/IFN-β(i.v.)显示出比其他各组更为显著的抑制肿瘤生长的效应,结果提示GMSCs/IFN-β在肿瘤组织局部分泌释放IFN-β可能发挥抑制TSCC生长的效应,反映出GMSCs作为IFN-β释放载体对TSCC治疗安全有效,具有良好的应用前景。