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目的：经体外分离培养兔角膜内皮细胞(CECs)，传代后接种于人羊膜基底膜(HABM)载体，观察CECs在羊膜载体上的生长情况；另外将CECs接种于经聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)接枝包被的聚苯乙烯细胞培养板(TCPs)表面，观察CECs在PNIPAAm上的生长和脱附情况。研究HABM作为CECs培养移植载体及利用PNIPAAm培养制作人工角膜内皮植片的可行性。
方法：采用胰酶消化法、组织块贴壁法和揭膜联合中性蛋白酶(dispaseⅡ)消化法等不同方法分离CECs并绘制细胞生长曲线；用细胞间隙连接蛋白(Connexin43)对培养的细胞进行DAB和FITC免疫组织化学染色鉴定。采用胰酶联合Ⅳ型胶原酶消化处理羊膜，制备HABM载体，将体外培养的第一、二代CECs接种于HABM上皮细胞面，体外培养1m后，羊膜片行HE染色及Na+-K+ATP酶免疫学鉴定；采用过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)等化学聚合合成PNIPAAm，利用紫外光固定法对TCPs进行接枝聚合N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAm），经过红外线光谱检测表征后，将体外培养的CECs接种于经PNIPAAm接枝的TCPs表面，观察CECs和PNIPAAm的生物相容性及细胞脱附情况。
结果：
1、采用揭膜加dispaseⅡ分离CECs，所获得的细胞活性好、贴壁快，原代培养5～6d基本融合成均一、密集的单层多角形细胞。体外培养的CECs行Cx43DAB和FITC免疫组织化学染色细胞阳性标记率达95％。
2、CECs接种于HABM上皮细胞面4w后，可见CECs生长融合成单层片状结构，具有典型的均一、规则的多边形样结构。组织片Na+-K+ATP酶DAB染色，细胞面表达呈阳性。但CECs在HABM上生长会增厚呈网格状，波浪状、皱褶样结构改变。
3、采用化学合成法和光固定法均能合成PNIPAAm聚合体，但CECs在水凝胶表面贴壁生长困难，而在光固定接枝后的TCPs上生长良好，培养4～6d后细胞融合，继续培养2w见细胞基底部会形成一层细胞外基质(ECM)，将细胞从37℃移至20℃环境下培养1h，ECM连同CECs呈膜片状从细胞培养板表面脱落下来。
结论：
1、通过揭膜联合dispaseⅡ消化法，可以获得数量较多、活性较好的CECs;
2、采用胰酶联合胶原酶消化处理羊膜，可以制备HABM载体，接种CECs后细胞生长良好，培养的细胞形态及功能与体内的内皮细胞相似。
3、光固定法可以成功将NIPAAm接枝到细胞培养板表面，且细胞相容性好，随着培养温度的不同，培养的CECs与ECM可以一起呈膜状从PNIPAAm表面脱落。