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目的:经体外分离培养兔角膜内皮细胞(CECs),传代后接种于人羊膜基底膜(HABM)载体,观察CECs在羊膜载体上的生长情况;另外将CECs接种于经聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)接枝包被的聚苯乙烯细胞培养板(TCPs)表面,观察CECs在PNIPAAm上的生长和脱附情况。研究HABM作为CECs培养移植载体及利用PNIPAAm培养制作人工角膜内皮植片的可行性。
方法:采用胰酶消化法、组织块贴壁法和揭膜联合中性蛋白酶(dispaseⅡ)消化法等不同方法分离CECs并绘制细胞生长曲线;用细胞间隙连接蛋白(Connexin43)对培养的细胞进行DAB和FITC免疫组织化学染色鉴定。采用胰酶联合Ⅳ型胶原酶消化处理羊膜,制备HABM载体,将体外培养的第一、二代CECs接种于HABM上皮细胞面,体外培养1m后,羊膜片行HE染色及Na+-K+ATP酶免疫学鉴定;采用过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)等化学聚合合成PNIPAAm,利用紫外光固定法对TCPs进行接枝聚合N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm),经过红外线光谱检测表征后,将体外培养的CECs接种于经PNIPAAm接枝的TCPs表面,观察CECs和PNIPAAm的生物相容性及细胞脱附情况。
结果:
1、采用揭膜加dispaseⅡ分离CECs,所获得的细胞活性好、贴壁快,原代培养5~6d基本融合成均一、密集的单层多角形细胞。体外培养的CECs行Cx43DAB和FITC免疫组织化学染色细胞阳性标记率达95%。
2、CECs接种于HABM上皮细胞面4w后,可见CECs生长融合成单层片状结构,具有典型的均一、规则的多边形样结构。组织片Na+-K+ATP酶DAB染色,细胞面表达呈阳性。但CECs在HABM上生长会增厚呈网格状,波浪状、皱褶样结构改变。
3、采用化学合成法和光固定法均能合成PNIPAAm聚合体,但CECs在水凝胶表面贴壁生长困难,而在光固定接枝后的TCPs上生长良好,培养4~6d后细胞融合,继续培养2w见细胞基底部会形成一层细胞外基质(ECM),将细胞从37℃移至20℃环境下培养1h,ECM连同CECs呈膜片状从细胞培养板表面脱落下来。
结论:
1、通过揭膜联合dispaseⅡ消化法,可以获得数量较多、活性较好的CECs;
2、采用胰酶联合胶原酶消化处理羊膜,可以制备HABM载体,接种CECs后细胞生长良好,培养的细胞形态及功能与体内的内皮细胞相似。
3、光固定法可以成功将NIPAAm接枝到细胞培养板表面,且细胞相容性好,随着培养温度的不同,培养的CECs与ECM可以一起呈膜状从PNIPAAm表面脱落。