有丝分裂是真核细胞最基本的生物学过程,细胞通过一系列蛋白质在时间和空间上的精密调控来保证遗传物质稳定、保真地传递给子细胞,维持基因组的稳定性。当参与有丝分裂的关键因子调控异常时往往会导致很多灾难性的事件,其中最广为关注的是肿瘤的发生。目前越来越多研究显示肿瘤的发生发展与许多细胞周期蛋白质的调控异常密切相关。因此针对有丝分裂调控的分子机制的探索,可以为肿瘤的靶向治疗提供多向选择的药靶为深入研究有丝分裂期的调控机制,本项工作采用联合数据库检索和siRNA筛选的策略进而鉴定有丝分裂新的调控因子。通过这样的方法,我们发现Cdc5L蛋白质参与有丝分裂M期的调控。目前研究表明Cdc5L(Cell division cycle 5-like protein)能够在G2/M期转化过程中发挥功能,在细胞中过表达Cdc5L将促进G2/M期的转化。此外Cdc5L还与细胞周期检查点蛋白ATR存在相互作用并激活ATR下游效应因子Chk1、Rad17等,干涉Cdc5L使S期细胞周期检查点失活,增加对复制叉阻断药物的敏感性。Cdc5L与肿瘤的关系亦十分密切,有研究表明Cdc5L与骨肉瘤的进展以及病人的不良预后相关。目前还没有Cdc5L参与调控M期表型及分子机制的报道,但有磷酸化蛋白质组文献鉴定出Cdc5L与M期相关的磷酸化位点,提示Cdc5L可能参与M期调控。因此,深入研究Cdc5L在M期参与的功能及其分子机制具有重要意义。我们的研究结果表明,非同步化细胞干涉Cdc5L后出现了非常明显地G2/M期阻滞和细胞死亡效应。通过Noc.释放的实验证明干涉Cdc5L确实可以显著地抑制M期进程,在Noc.释放2h时,对照组大部分细胞已经出M期、进入G1期,但是Cdc5L干涉组细胞大部分仍处于M期,说明Cdc5L是M期正常进程所必需的。Time-lapse实验进一步的实验发现Cdc5L在M期的前中期染色体排列至赤道板过程中发挥重要功能。但是,干涉Cdc5L并不影响纺锤体的组装,而是抑制了着丝粒和微管的附着过程。由于干涉Cdc5L后着丝点和微管不能连接,所以纺锤体的形态变长,微管弯曲,着丝点内缺乏张力,并激活有丝分裂纺锤体检查点。已知着丝点蛋白KNL1和NDC80复合体是负责着丝点直接与微管连接的两个重要组成,我们通过免疫荧光检测了Cdc5L对KNL1和NDC80复合体定位的影响。结果表明,Cdc5L减弱了KMN network(KNL-1/Mis12 complex/Ndc80 complex Network)中KNL1的着丝粒定位,但是却没有影响NDC80复合体的着丝点定位。已知KNL1的着丝点定位对于其参与着丝点与微管附着过程是必需的,因此我们的研究结果提示Cdc5L有可能是通过调控KNL1的着丝点定位而发挥其自身功能。此外着丝点与微管之间的作用受到Aurora B激酶与PP1磷酸酶的双向调节。Aurora B激酶磷酸化底物,使着丝点-微管之间的连接解聚,促进着丝点-微管错误连接的纠正;而PP1通过底物去磷酸化稳定与着丝点正确连接的微管。KNL1是Aurora B激酶底物之一,而我们的研究结果显示Cdc5L并没有影响Aurora B的激酶活性,提示Cdc5L不是通过Aurora B激酶活性来调控KNL1。由于在M期过程中Cdc5L定位于胞浆,与着丝粒没有共定位现象,说明Cdc5L并不能直接招募KNL1于着丝点,而是通过其他的调节方式或其他蛋白质间接地影响KNL1。综上,Cdc5L是一个新发现的、在M期发挥重要功能的蛋白质,Cdc5L通过KNL1调控着丝粒与微管的附着过程、参与前中期染色体的排列、保证M期正常进行。