背景恶性肿瘤(malignant tumor)是当今严重威胁人类健康的恶性疾病之一。随着科技发展，研究者对其发病机制和治疗策略的认识从组织器官水平到到蛋白核酸等大分子水平，不断深入。50年代发现诱发及自发的动物肿瘤均表达肿瘤相关抗原，此抗原可诱导荷瘤个体产生特异性免疫应答。据此，Burnet和Thomas分别于1950年和1960年提出“免疫监视”(immunosurveillance)学说，其要点为：免疫系统可监视肿瘤细胞的发生并通过细胞免疫机制杀灭肿瘤，若免疫功能低下则可能发生肿瘤。肿瘤细胞发生免疫逃逸(immune escape)的可能机制包括：(1)肿瘤抗原的变异；(2)MHC分子表达水平下调或缺失；(3)抗原处理通路的改变导致无法将肿瘤特异性抗原递呈给T细胞；(4)肿瘤局部的细胞因子缺乏或肿瘤细胞分泌免疫抑制因子；(5)其他：诸如许多肿瘤细胞合成大量的糖萼(glycocalyx)，形成类似细菌胞壁的多糖包被，等等。目前，基因水平的治疗为一些难治性疾病提供了新的治疗手段。肿瘤的基因治疗主要是通过向肿瘤细胞导入有治疗价值的基因，从而诱导机体产生有效的抗肿瘤免疫应答及增强对肿瘤的特异性识别等。导入的外源基因主要包括某些免疫因子(如细胞因子、MHC、共刺激分子)编码基因、抗癌基因、反义寡核苷酸、肿瘤药物相关基因及病毒基因等。抗肿瘤免疫主要是CTL的杀伤作用。T细胞活化增殖过程需要双信号，T细胞表面受体(TCR)对主要组织相容性复合物(MHC)-抗原肽复合物的特异性识别为T细胞活化提供了必需条件之一，即第一信号；第二信号又称共刺激信号(costimulatory signal)，由抗原递呈细胞(APC)表面及T细胞表面的共刺激分子的相互作用所提供。诸多参与T细胞活化的共刺激分子中，最重要的是T细胞表面CD28分子与APC表面相应配体CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的结合。若仅有第一信号而缺乏第二信号，将导致免疫无应答。CD80分子作为参与细胞免疫应答第二信号的重要分子，与肿瘤细胞的免疫逃逸密切相关，大多数肿瘤细胞缺乏CD80分子的表达，不能有效地启动第二信号，是其发生免疫逃逸的原因之一。利用基因转染技术，将诸如CD80等共刺激分子表达于肿瘤细胞表面，能产生更多的致敏肿瘤细胞，后者诱导对抗亲代肿瘤攻击的保护性免疫。虽然基因转染法在肿瘤免疫基因治疗上起重要作用，但基因转染法亦有其局限性，如原代细胞较难转染、转染效率较低、基因的降解、基因整合后的潜在致瘤性问题、耗时长等，都阻碍了基因转染法进行肿瘤治疗的临床应用。我们可以选择一种不同的方法将CD80分子转移至肿瘤细胞表面。通过分子克隆技术，将糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatedylinositol，GPI)结构与某种蛋白嵌合表达，此法制备的目的蛋白能借助GPI结构锚定于多种细胞膜表面，并可保持与其天然配体结合的能力，含GPI结构的蛋白能够有效地对细胞表面进行修饰，这种不通过基因转染手段使目的蛋白在靶细胞膜上表达的方法叫蛋白转染法，也称细胞表面工程(cell-surface engineering)。基于GPI锚定蛋白的细胞表面工程技术，与传统的基因转染法相比有很多优势，例如：1)GPI锚定蛋白可以锚定于难于转染的细胞；2)减少细胞的培养时间而迅速改变细胞表面性状；3)表达于细胞膜的目的蛋白的量可以被精确控制；4)不同种GPI锚定蛋白可以相继或同时锚定于同一种细胞膜。本实验分三部分介绍人GPI-CD80融合蛋白从载体构建到蛋白表达以及锚定于肿瘤细胞膜的过程，为进一步借助细胞表面工程技术，研发基于CD80分子介导的肿瘤疫苗打下基础。第一部分人GPI-CD80真核表达载体的设计与构建CD58分子又称LFA-3，天然情况下具有跨膜和锚定两种形式，后者的基因中含有GPI锚定信号序列，据此可以作为目的蛋白的GPI序列来源。CD80分子也称B7-1，其胞外段具有与T细胞表面分子CD28结合的能力，进而活化T细胞。目的：设计获取源于人CD58的GPI锚定信号肽序列，并与人CD80基因胞外段融合，构建真核表达载体，即pReceiver-M10／GPI-hCD80，为后续实验准备必需的实验材料。方法：根据Genbank提供的人CD58和CD80基因的参考序列，设计引物P1、P2，PCR扩增CD80基因的胞外段，设计引物P3、P4 PCR扩增CD58基因的GPI信号序列，利用重叠延伸PCR技术(splicing overlap extension，SOE)将两片段拼连接起来，先连入T载体，再双酶切连入真核表达载体pReciever-M10。对构建的重组载体进行双酶切和测序鉴定。结果与结论：PCR法成功获取了人CD80胞外段和来源于人CD58的GPI锚定信号序列。重组质粒中插入目的片断的测序结果与NCBI提供的参考序列基本相符，将该重组质粒命名为pReceiver-M10／GPI-hCD80。第二部分pReceiver-M10／GPI-hCD80载体在COS-7细胞的瞬时表达及产物的纯化与鉴定COS-7细胞可以瞬时大量表达蛋白，可以用于迅速鉴定构建的载体可否在真核细胞中表达出目的蛋白，进而验证真核表达载体构建成功与否。目的：pReceiver-M10／GPI-hCD80载体在COS-7细胞的瞬时表达及表达产物的纯化与鉴定，为融合基因的稳定表达奠定基础。方法：(1)大量提取超纯的pReceiver-M10／GPI-hCD80载体，脂质体法转染生长活跃的COS-7细胞，称实验组，转染不带目的基因的pReceiver-M10空载体作阴性对照，未转染的细胞作为空白对照。分别对实验组、阴性对照组及空白组细胞作如下检测，以分析CD80蛋白的表达情况：①间接免疫荧光检测；②流式细胞计数检测；③提取总蛋白作聚丙烯酰胺-凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot；④提取总RNA做RT-PCR，产物进行琼脂糖凝胶电泳估计碱基数。(2)PI-PLC处理：用PI-PLC，37℃处理实验组、空白对照组、阴性对照组、阳性对照组细胞(成功转染了人CD80基因的U251细胞)各1 h，然后流式细胞计数处理前后细胞荧光强度的变化。(3)融合蛋白的纯化：大量提取转染组COS-7细胞总蛋白，用Ni-NTA凝胶纯化柱纯化目的蛋白。纯化后的蛋白样品做SDS-PAGE。结果与结论：(1)实验组：间接免疫荧光法可见COS-7细胞发出绿色荧光：流式细胞计数显示CD80~+细胞占32.7％：SDS-PAGE在约60KD位置有一明显蛋白条带，Western blot显示出条带：RT-PCR后琼脂糖凝胶电泳在约840bp位置显示核酸条带。对照组：各检测结果均为阴性。(2)只有实验组在PIPLC处理后荧光强度明显变弱，对照组基本没有变化。(3)纯化的蛋白SDS-PAGE结果位于约60KD处。综合上述各实验结果，可以得出结论：重组质粒pReceiver-M10／GPI-hCD80转染COS-7细胞后，表达了GPI锚定形式的人CD80(GPI-hCD80)融合蛋白。第三部分GPI-CD80蛋白锚定于胶质瘤细胞系U251及原代胶质瘤细胞COS-7细胞表达的融合蛋白需具有GPI结构，该融合蛋白才可以锚定于肿瘤细胞膜。作为以临床应用为最终目的肿瘤疫苗，GPI-hCD80融合蛋白能否锚定于原代肿瘤细胞膜，具有重要意义。目的：从临床手术标本中分离培养原代胶质瘤细胞，将GPI-CD80蛋白锚定于胶质瘤细胞系U251及原代胶质瘤细胞膜表面，以证实生产的融合蛋白具有锚定功能，为后期大量生产蛋白用于动物实验提供实验依据。方法：胰酶消化法结合组织培养法，体外分离培养原代人胶质瘤细胞。将GPI-hCD80融合蛋白与消化处理的U251、原代胶质瘤细胞共孵育37℃，4 h，直接免疫荧光法观察肿瘤细胞膜表面GPI锚定形式CD80的表达情况。结果与结论：荧光显微镜下可见，锚定实验组两种细胞表面均发出红色荧光。说明GPI-hCD80融合蛋白可以借助GPI锚定结构结合于肿瘤细胞膜表面。总结成功获取了人CD80基因胞外段及来源于人CD58基因的GPI片段，并构建了人GPI-CD80真核表达载体pReceiver-M10／GPI-hCD80，并证实该载体在COS-7细胞中表达出的GPI-CD80融合蛋白具有锚定作用。为今后进一步研究该融合蛋白锚定于肿瘤细胞后的生物学活性，以及作为肿瘤疫苗在体内是否可以介导肿瘤细胞杀伤作用奠定了基础。