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研究目的肺癌是目前全球所有地区发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。尽管近年来,在肺癌的治疗方面,分子靶向药物进展迅速;但是目前大多数晚期肺癌患者仍然缺乏有效的治疗药物,尤其发生转移的晚期肺癌患者。因此,亟需探寻全新的肺癌药物作用靶点。近年来研究发现去泛素化酶USP18(Ubiquitin-Specific Peptidase 18,USP18)的表达可能与肺癌等恶性肿瘤有关,但具体调控机制不明,导致缺乏有效的干预手段。我们前期采用USP18敲除的小鼠等研究模型,发现去泛素化酶USP18可能具有调控脂质代谢,并可能因此发挥促进肺癌细胞增殖的作用。本研究还发现USP18对细胞的迁移运动能力也有明显的调控作用,进而导致肺癌细胞的迁移和侵袭能力增加。因此,本课题将探索研究去泛素化酶USP18调控肺癌代谢和转移的机制,明确USP18在调控肺癌代谢及转移侵袭过程中的关键作用,从而为肺癌治疗提供全新的靶点。研究方法:(1)USP18的表达与肺癌关系的研究:采用肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)临床数据库分析USP18表达水平与肺癌患者存活情况的相关性。(2)USP18敲除减少脂质代谢的作用研究:采用动物身体组成分析对USP18敲除的小鼠进行检测,观察USP18对脂质代谢的影响;采用体内脂质分解实验对USP18敲除的小鼠进行检测,观察USP18对脂肪分解率的影响;采用血浆参数分析考察去泛素化酶USP18对血浆葡萄糖,总甘油三酸脂,总胆固醇,脂联素等指数的影响;采用脂质代谢分析观察USP18过表达对脂质代谢的影响。(3)研究USP18调控ATGL的分子机制:采用Western Blotting考察USP18酶活功能对ATGL蛋白水平的影响;采用免疫沉淀技术和Western Blotting考察ISG15与ATGL的结合作用。(4)USP18敲除对UCP1表达及脂肪酸氧化和肿瘤形成的影响:将USP18敲除小鼠放于低温环境观察USP18对小鼠体内温度调节水平的影响;采用Western Blotting考察USP18酶活功能对UCP1蛋白水平的影响;采用seahorse和β-羟基丁酸比色法分析考察UCP1对脂肪酸氧化速率的影响;采用Cell Titer-Glo发光技术考察UCP1对肺癌细胞生长的影响。(5)USP18,ATGL和UCP1的表达与肿瘤关系的研究:采用TCGA临床数据库分析USP18、ATGL和UCP1的表达水平与肿瘤患者存活情况的相关性。(6)USP18对肺癌细胞体内外转移和侵袭的研究:采用划痕修复和Transwell考察USP18对肺癌细胞体外转移的影响;使用同源小鼠肺癌转移模型观察USP18对肺癌细胞体内转移的影响。(7)筛选发现USP18通过影响14-3-3ζ蛋白水平影响肺癌细胞的转移和侵袭:采用RPPA寻找被USP18影响的转移相关蛋白;采用Western Blotting考察USP18对14-3-3ζ蛋白水平的影响;采用TCGA临床数据库分析14-3-3ζ表达水平与肿瘤患者存活情况的相关性;采用Transwell考察14-3-3ζ对USP18敲除的肺癌细胞转移侵袭能力的影响。研究结果:(1)USP18的表达与肺癌关系的研究:TCGA临床数据库分析发现USP18在肺癌病人中的表达水平比在正常人中明显升高,而且肺癌病人存活情况也与USP18表达水平呈负相关。(2)USP18敲除减少脂质代谢的作用研究:通过身体成分分析,我们发现在USP18敲除的小鼠中,脂肪重量,脂肪比例和体重与正常小鼠相比都有显著上升;进一步采用溶质实验分析发现相比与正常小鼠,USP18敲除的小鼠脂肪分解率明显降低;采用血浆参数分析发现相比与正常小鼠,USP18敲除的小鼠血清脂联素和高密度脂蛋白明显降低。(3)研究USP18调控ATGL的分子机制:USP18调控ATGL的蛋白水平依赖于其去泛素化活性;敲低USP18可诱导ATGL发生泛素-蛋白酶体降解;免疫沉淀实验说明ISG15与ATGL存在结合,证明USP18直接通过其类去泛素化作用调控ATGL蛋白水平。(4)USP18敲除对UCP1表达及脂肪酸氧化和肿瘤形成的影响:体内温感实验证明USP18敲除的小鼠相比于正常小鼠对温度更敏感;敲除USP18可诱导UCP1降解;过表达USP18可诱导UCP1累积;Seahorse和β-羟基丁酸比色法分析证明UCP1过表达会显著提升脂肪酸氧化水平;当敲低或过表达UCP1时肺癌细胞的增殖能力也随之下降或上升。(5)USP18,ATGL和UCP1的表达与肿瘤关系的研究:采用TCGA临床数据库分析发现USP18,ATGL和UCP1的表达水平不仅和肺癌患者存活情况呈显著负相关,还和前列腺腺癌,肾细胞癌,低度脑胶质瘤患者存活情况呈显著负相关。(6)USP18对肺癌细胞体内外转移和侵袭的研究:体外转移和侵袭实验均表明敲低USP18可显著抑制肺癌细胞体外的转移和侵袭;同源小鼠皮下注射和尾静脉注射肺癌转移模型证明敲低USP18可显著抑制肺癌细胞体内的转移和侵袭。(7)筛选发现USP18通过影响14-3-3ζ蛋白水平影响肺癌细胞的转移和侵袭:RPPA结果表明14-3-3ζ在肺癌人源,鼠源细胞中的表达都与USP18表达呈正相关;敲低USP18可诱导14-3-3ζ降解;TCGA临床数据库分析14-3-3ζ表达水平不仅与肺癌患者存活情况呈显著负相关还与乳腺癌,肾细胞癌,肾乳头状细胞癌,胰腺癌,葡萄膜黑色素瘤呈显著负相关;过表达14-3-3ζ会恢复USP18敲除的肺癌细胞的转移和侵袭能力。研究结论:USP18在肺癌代谢和转移过程中起到至关重要的作用。USP18类去泛素化调控ATGL蛋白水平,所以在USP18敲除的小鼠模型中,ATGL泛素-蛋白酶体通路降解的途径被激活,ATGL蛋白降解,进而抑制脂肪分解率,从而使小鼠的脂肪重量,脂肪比例和体重显著上升;抑制USP18可使小鼠对温度的敏感性显著提升,而引入USP18可调控UCP1的表达,进而影响依赖UCP1的脂肪酸氧化的水平,最终影响肺癌细胞的代谢和增殖能力。同时USP18可调控14-3-3ζ蛋白水平,进而影响肺癌细胞在体内和体外的转移和侵袭能力。综上,本研究不仅发现了USP18在肺癌代谢和转移过程中的重要作用,还揭示了USP18对ATGL,UCP1和14-3-3ζ蛋白水平的调控能力,为将来临床肺癌治疗提供新的靶点和新的思路。