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食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是我国最常见且最具侵袭性的恶性肿瘤之一,预后较差。由于其发病隐匿,不易发现,就诊时中晚期患者占比较高,5年生存率仅有15-30%,采取同样治疗方案但是患者预后却差别极大,提示我们ESCC肿瘤异质性对于预后的影响极为显著。放化疗或术后放化疗是中晚期ESCC的主要治疗方式,但化疗、放疗敏感性的个体差异较大,因此现阶段ESCC放化疗敏感性、预后及正常组织损伤预测等研究方面,普遍存在候选因素单一、预测效能低等弊端,现阶段没有获得公认的、预测效能较高的方法预测ESCC的放化疗敏感性,难以实际指导临床个体化治疗。因此,寻找更多标志物,建立预测效能更高的ESCC放化疗敏感性预测标准,是指导临床个体化治疗亟待解决的难点。目前认为食管癌的发生发展是多种环境因素与宿主基因组相互作用,并经长时间与多阶段演化的结果。研究显示高危亚型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染使野生型P53蛋白泛素化、分解、失活,可能为ESCC的重要病因之一。近年来一部分针对HPV对口咽癌、食管癌及头颈部鳞癌放化疗敏感性的研究,却给出了许多自相矛盾的结论。既往研究表明HPV阳性ESCC放疗敏感性较高,预后较好,然而也有研究显示两者并无相关性。本研究前期工作发现HPV感染可能与p53基因共同影响ESCC放疗敏感性。本研究从HPV对P53等细胞周期相关蛋白作用的角度入手,探索HPV如何与p53基因共同影响ESCC放疗敏感性。第一部分:探索HPV16-E6对突变型ESCC细胞放疗敏感性的影响。研究目的:当前众多研究关于HPV对ESCC放疗敏感性的作用结论不一致,本研究的前期工作发现p53突变可能影响HPV对ESCC放疗敏感性的作用,该部分将HPV16-E6癌基因导入TE1细胞,探索HPV16-E6对携带p53 V272M突变ESCC放疗敏感性的影响。研究方法:1.利用慢病毒载体分别将HPV16-E6和空载质粒分别导入TE1细胞;2.Western Blot实验验证转染效果;3.克隆形成实验检测HPV16-E6对TE1细胞放疗敏感性的影响;4.放疗细胞毒性检测细胞增殖抑制率。研究结果:1.HPV16-E6成功导入细胞并稳定表达目标蛋白;2.导入HPV16-E6后突变型P53蛋白含量稳定;3.导入HPV16-E6后TE1细胞放疗敏感性显著升高(p<0.05);4.导入HPV16-E6后TE1细胞增殖抑制率显著升高(p<0.001)。研究结论:HPV16-E6可以提高TE1细胞放疗敏感性;HPV16-E6可能不能降解突变型P53蛋白。第二部分:探索HPV16-E6对不同p53基因状态的ESCC细胞放疗敏感性的作用。研究目的:探索HPV16-E6对不同p53基因状态的ESCC放疗敏感性的作用,探索HPV16-E6对野生/突变型P53蛋白的泛素化作用,本部分利用p53 R175H突变及HPV16-E6两种慢病毒载体分别转染p53野生型ECA109细胞,探索这两种干预因素对细胞放疗敏感性的作用。研究方法:1.利用p53 R175H突变及HPV16-E6两种慢病毒载体分别或共同转染ECA109细胞,建立ECA109-Mp53、ECA109-HPV、ECA109-Mp53-HPV三株细胞,空载体质粒转染ECA109建立ECA109-NC作为空白对照组;2.免疫荧光及Western Blot验证转染效果;3.免疫共沉淀验证HPV16-E6与R175H、V272M突变型P53蛋白结合情况;4.克隆形成实验检测细胞放疗敏感性变化;5.放疗细胞毒性检测细胞增殖抑制率。研究结果:1.ECA109-NC、ECA109-Mp53、ECA109-HPV、ECA109-Mp53-HPV四株细胞均转染成功;2.免疫荧光及Western Blot验证显示目的蛋白成功表达;3.免疫共沉淀结果显示HPV16-E6能结合野生型P53蛋白,不能结合R175H、V272M突变型P53蛋白;4.克隆形成实验显示HPV16-E6可降低ECA109细胞放疗敏感性,可提高ECA109-Mp53细胞放疗敏感性(p<0.05);5.放疗细胞毒性检测显示HPV16-E6可降低ECA109细胞增殖抑制率(p=0.001),可提高ECA109-Mp53细胞增殖抑制率(p<0.001)。研究结论:1.HPV16-E6能结合野生型P53蛋白,不能结合R175H、V272M突变型P53蛋白;2.HPV16-E6可增加p53突变ESCC放疗敏感性,降低p53野生型ESCC放疗敏感性。第三部分:裸鼠成瘤实验验证HPV16-E6对不同p53基因状态的ESCC放疗敏感性的影响。研究目的:为了明确HPV16-E6对不同p53基因状态的ESCC放疗敏感性的影响,我们建立六株细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,对裸鼠移植瘤型0/6Gy放疗,检测肿瘤生长抑制率,免疫组化检测肿瘤增殖系数Ki-67,分析HPV16-E6对不同p53基因状态ESCC放疗敏感性的影响。研究结果:1.HPV16-E6显著提高TE1细胞、ECA109-Mp53细胞放疗体积生长抑制率;降低ECA109细胞放疗体积抑制率。2.HPV16-E6显著提高TE1细胞、ECA109-Mp53细胞增殖系数Ki-67(p<0.05);降低ECA109细胞增殖系数Ki-67(p<0.05)。研究结论:HPV16-E6提高TE1、ECA109-Mp53细胞增殖系数Ki-67及放疗敏感性,降低ECA109增殖系数Ki-67及放疗敏感性。