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研究背景与目的肝细胞性肝癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是我国常见恶性肿瘤之一,有较高发病率和死亡率,早期肝癌病人可行手术切除、射频消融或肝移植,但由于肝癌起病隐匿,大多数患者就诊时已为晚期,所以寻找有效治疗靶点和预后评估分子是降低肝癌死亡率的有效方法。在肝癌等实体肿瘤中,由于肿瘤细胞的快速增长消耗了大量的氧气,而血管再生速率不足导致无法提供充足氧气,使得肿瘤组织中形成了相对缺氧的微环境。在缺氧条件下,转录因子乏氧诱导分子（Hypoxia-inducible factor,Hif1α）可以稳定表达,进入细胞核,通过结合下游靶基因启动子区中的乏氧反应元件（Hypoxia-responsive element,HRE）,影响下游靶基因的转录。有许多文献报道Hif1α在多种肿瘤的发生发展中起着重要作用,并且与患者预后呈正相关关系。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是长度大于200个碱基并且不编码蛋白质的基因转录产物,通过调控基因的表达来发挥不同功能,但目前绝大多数lncRNA与生物学功能的相关性仍然不被大众所知,所以继续寻找能够发挥生物学功能的lncRNA至关重要。本研究中,我们结合芯片高通量测序与TCGA（The Cancer Genome Atlas,TCGA）肝癌患者lncRNA数据库,筛选出了 lncRNA AP000695.4,旨在探讨lncRNA AP000695.4在肝癌中的生物学功能及其分子机制,以及对肝癌预后评估的临床意义。研究内容和方法通过qRT-PCR验证15对肝癌组织及癌旁非肿瘤组织中的lncRNA AP000695.4表达情况,以及通过Kaplan-Meier生存曲线分析（n=200）,探讨lncRNAAP000695.4的表达情况与患者预后之间的关系。qRT-PCR检测各肝癌细胞株中lncRNA AP000695.4的转录本表达情况,通过5’RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE）和3’RACE实验测定转录本的全长。构建带有Flag标签的lncRNAAP000695.4全长质粒,Western blot检测其在真核细胞中的非编码特性。转染siRNA干扰lncRNAAP000695.4和构建lncRNA AP000695.4稳定过表达的肝癌细胞株,通过EdU以及CCK-8实验,探讨lncRNAAP000695.4在肝癌细胞中的增殖功能。qRT-PCR及Western blot实验发现lncRNA AP000695.4与Hif1α及其下游糖酵解相关靶基因的相关性;转染siRNA干扰VHL,Western blot探讨VHL是否介导lncRNA AP000695.4对Hif1α的调控;通过加入放线菌酮（cycloheximide,CHX）抑制蛋白合成,探讨 lncRNAAP000695.4 是否延长 Hif1α的半衰期。转染siRNA干扰Hif1α,通过qRT-PCR确定Hif1α调控lncRNA AP000695.4的转录,通过ChIP实验,探讨Hif1α是否能够与lncRNAAP000695.4的启动子区结合并促进其转录。在稳定过表达lncRNA AP000695.4的细胞中转染siRNA干扰Hif1α,经过Edu实验、葡萄糖及乳酸测定实验,探讨lncRNA AP000695.4是否通过Hif1α来促进肝癌细胞的糖酵解水平与增殖功能,加入2-D,G抑制糖酵解,探讨糖酵解对于细胞增殖功能的影响。结果1.高表达lncRNAAP000695.4的肝癌患者有着较差的预后。1)与癌旁非肿瘤组织相比,lncRNAAP000695.4在肿瘤组织中高表达;2)LncRNA AP000695.4高表达的肝癌患者有着较短的总生存时间与无进展生存时间。2.LncRNAAP000695.4 的特性鉴定。1)LncRNAAP000695.4有两个转录本,其中202号转录本在各肝癌细胞株中高表达;2)5’RACE和3’RACE实验测定出lncRNA AP000695.4 202号转录本全长;3)lncRNAAP000695.4不具有编码能力。3.LncRNAAP000695.4促进肝癌细胞的增殖。过表达lncRNA AP000695.4后,肝癌细胞增殖能力上调;干扰lncRNA AP000695.4后,肝癌细胞增殖能力下调。4.LncRNAAP000695.4与Hif1α形成正反馈环路。1)GSEA预测lncRNA AP000695.4与乏氧相关,结合TCGA数据库,发现lncRNA AP000695.4与Hif1α及其下游糖酵解相关靶基因呈正相关关系;2)在肝癌细胞中,lncRNAAP000695.4通过影响E3泛素化连接酶VHL从而调控Hif1α的表达,促进Hif1α的稳定;3)乏氧诱导lncRNA AP000695.4转录,通过ChIP实验发现,Hif1α与lncRNA AP000695.4启动子区上的乏氧反应元件结合,促进lncRNA AP000695.4 的转录。5.LncRNA AP000695.4通过Hif1α发挥生物学效应。1)LncRNA AP000695.4的促进肝癌细胞增殖作用可以被Hif1α逆转;2)LncRNAAP000695.4的促进肝癌细胞糖酵解作用被Hif1α逆转;3)LncRNAAP000695.4的促进肝癌细胞增殖作用被2-D,G糖酵解抑制剂逆转。结论LncRNA AP000695.4在肝癌细胞中与Hif1α形成正反馈环路,影响肝癌细胞的糖酵解程度,促进肝癌细胞的增殖,对肝癌的发展起着一定影响。