血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)的增殖和分化受一系列调节因子构成的信号网络所调控。其中转录因子Krüppel样因子5(krüppel-like factor 5, KLF5)通过调节增殖/分化基因的表达活性而影响细胞的增殖活性。有研究显示,人工合成的维甲酸衍生物Am80通过激活其受体RARα而抑制KLF5与RARα相互作用和KLF5的活化,进而解除KLF5对p21基因表达的抑制。然而,Am80是通过何种机制抑制KLF5活性尚不清楚。乙酰化修饰在KLF5活性调节中具有重要意义,但对其在VSMC分化中的作用研究较少。本研究以组蛋白脱乙酰酶(histone deacetylases, HDACs)为切入点,以p21为靶基因,探讨KLF5乙酰化水平改变与其转录激活活性的关系,并揭示其作用机制。方法与结果:1 Am80抑制VSMC细胞周期的进程用流式细胞术检测细胞周期分布,结果显示,与对照组相比Am80刺激VSMC 24 h后,G0/G1期细胞所占比例上升了13 %,S期细胞比例下降了29 %。两组之间具有显著性差异。说明Am80可诱导细胞周期阻滞。2 Am80抑制VSMC增殖MTT分析结果显示,Am80刺激细胞12、24、48 h,VSMC增殖活性显著被抑制。与对照组相比,细胞增殖活性分别降低了44 %、35 %、26 %,该结果与细胞周期分析数据具有一致性。3 Am80诱导p21蛋白的表达为了探讨Am80诱导细胞阻滞的作用机制,我们选用不同浓度Am80刺激细胞24 h,提取总蛋白,观察细胞周期抑制蛋白p21表达的变化,Western blot结果显示,在Am80浓度为0-5μM范围内,随着Am80浓度增加,p21的表达水平呈剂量依赖性的升高,提示Am80可上调p21蛋白表达。4 Am80显著抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生与假手术组相比,球囊内皮剥脱后14天的模型组颈总动脉中膜内的VSMC排列紊乱,内膜呈弥散性增厚,管腔变小,内膜与中膜的厚度比值(I/M)(2.10±0.26)明显高于假手术组(0.18±0.08);Am80组新生内膜的增生程度和I/M比值(0.3±0.11)明显小于模型组(P < 0.05,n=3)。结果表明,Am80可以明显抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生。5 Am80通过抑制KLF5乙酰化上调p21表达为探讨Am80抑制p21表达的分子机制以及KLF5乙酰化水平变化是否在该过程中发挥作用,进行观察了Am80对KLF5乙酰化的影响。用不同浓度Am80(0、1、2、5和10μM)处理VSMC 2 h,提取细胞总蛋白,经抗KLF5抗体免疫沉淀后,用抗赖氨酸抗体进行Western印迹分析,以检测KLF5的乙酰化水平。结果显示,随着Am80浓度的增加,KLF5乙酰化水平逐渐降低,具有明显的剂量依赖关系。整体动物实验也证明,与模型组相比,给予Am80的大鼠血管组织中,KLF5乙酰化水平降低。在术后3 d和14 d时,Am80组血管乙酰化KLF5水平分别较模型组下降了17 %和34 %。上述结果在整体水平及细胞水平证实,Am80能抑制KLF5的乙酰化水平。6 Am80诱导KLF5与HDAC2相互作用HDAC2是调节蛋白质乙酰化修饰的关键酶。为确定HDAC2是否参与Am80诱导的KLF5脱乙酰化过程,本研究观察了KLF5与HDAC2的相互作用。免疫共沉淀分析结果显示,在Am80刺激前后的VSMC中,KLF5均可与HDAC2共沉淀;但是Am80刺激后,KLF5和HDAC2相互作用程度呈剂量依赖性增强,说明Am80能显著促进二者结合。免疫双荧光共定位分析结果进一步证实,在VSMC中KLF5与HDAC2共定位,叠加后的荧光强度随着Am80刺激而增强。给予RARα受体抑制剂Ro 41-5253预处理VSMC,可消除Am80诱导的KLF5与HDAC2相互作用。上述结果表明Am80诱导KLF5脱乙酰基与促进KLF5与HDAC2的相互作用有关。7乙酰化的KLF5促进p21启动子活性为了确定KLF5是否参与调节p21启动子活性以及与HDAC2相互作用对其转录激活作用的影响,分别将p21启动子指导的报告基因质粒(p21-luc)与KLF5和/或HDAC2表达质粒共转染293A细胞,通过双荧光素酶报告基因检测系统定量分析启动子的活性。结果显示,293A细胞共转染HDAC2和KLF5后,所测得荧光素酶的活性比单独转染KLF5升高了3倍。提示,KLF5与HDAC2对p21基因启动子的激活具有协同效应。为了确定该协同效应是否与KLF5的乙酰化有关,进而构建KLF5乙酰化位点突变(K369R)的表达质粒,并分别将其与乙酰化酶p300表达质粒和p21-luc共转染293A细胞,观察对报告基因活性的影响。结果显示,p300和KLF5表达质粒共转染细胞时,可协同抑制报告基因的表达活性。当KLF5突变体与P300表达质粒共转染时,对p21启动子的协同抑制作用消失。上述结果表明:KLF5的乙酰化抑制p21的表达;KLF5的去乙酰化促进p21的表达。结论:1 Am80阻滞VSMC细胞周期进程;2 Am80抑制VSMC增殖;3 Am80通过诱导HDAC2与KLF5的相互作用而促进KLF5的脱乙酰化;4 KLF5对p21基因的转录抑制有赖于其乙酰化修饰。