研究背景和目的：甲基苯丙胺(Methamphetamine, METH)是一种新型毒品,由于合成技术简单、合成原料容易获得,已成为世界上广泛滥用、快速蔓延、危害最重的毒品之一。因此,对METH毒性损伤作用及其机制的研究已成为世界面临的重大课题和研究热点。METH具有很强的中枢兴奋作用且易形成药物依赖性,对心、肝、肾等多种组织器官均有毒性作用,特别是对中枢神经系统的毒性。研究显示,METH可致动物大脑多巴胺能神经末梢损伤,引起纹状体内多巴胺耗竭、含量下降、多巴胺转运体降低、酪氨酸羟化酶活性减少、多巴胺摄取位点及单胺囊泡转运体2的缺失。目前,关于METH的神经毒性机制尽管国内外进行了大量研究,但结果尚未完全明确,主要集中于以下3种机制：多巴胺系统失常和氧化应激损伤、谷氨酸和一氧化氮、线粒体功能失常及神经元的凋亡等。本教研室关于METH神经毒性的前期研究中首次发现METH大鼠模型组纹状体、皮质、海马三个脑区中α-突触核蛋白(α-synuclein, α-SN)表达明显升高,并应用western blot进行了验证。大量证据表明,α-SN的异常表达、聚集和纤维化与帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病的发病密切相关,也是帕金森病等疾病药物治疗的作用靶点。α-SN被发现与上述疾病中多巴胺递质释放减少、氧化应激损伤、细胞膜结构破坏、Ca2+超载、线粒体功能损伤和细胞凋亡等多种损伤机制密切相关。已有研究发现METH作用于SK-N-SH细胞(神经母细胞瘤细胞)后α-SN表达升高。然而,对a-SN在METH致神经退行性病变中的作用和机制的研究还未见有报道,需要研究证实。RNA干扰(RNAi)技术对于研究基因功能是一种有效的工具,它可在转录后水平高效特异地抑制目标基因的表达。Sapru MK等应用RNAi技术已经成功地对人多巴胺能神经细胞系SH-SY5Y中内源性的a-SN进行了有效沉默。本研究参照Sapru MK等的实验方法,通过RNAi技术沉默α-SN基因,并获得稳定转染a-SN shRNA慢病毒表达载体的细胞株,进而研究α-SN在多巴胺系统失常、氧化应激、线粒体功能损伤以及细胞凋亡等METH神经毒性方面的功能,以期为深入研究METH所致神经毒性的作用机理提供理论基础,并为药物筛选提供靶点。方法：1.不同剂量METH作用SH-SY5Y细胞后的a-SN表达变化10%新生胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基接种SH-SY5Y细胞至培养瓶中,在37℃和5%CO2条件下培养,待细胞长至80%汇合时,用终浓度0.5mmol/L、1.5mmol/L、2.5mmol/L、3.5mmol/L、4.5mmol/L,培养24h后处理。收集上述各组细胞,倒置显微镜下观察细胞形态变化,CCK-8法检测细胞活力变化,Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞术结检测细胞早期凋亡率,实时荧光定量PCR、Western Blot分别检测a-SN在基因和蛋白水平的表达变化。2.干扰α-SN表达的SH-SY5Y细胞株的建立及沉默效果检测(1)根据文献报道的有效siRNA序列和白行设计的2条siRNA,结合pLVTHM载体的结构特点,合成3对shRNA,构建shRNA表达质粒载体,并通过DNA测序对构建的质粒载体进行鉴定。(2)对上述质粒载体进行慢病毒包装和病毒滴度测定后,转染SH-SY5Y细胞。(3)用实时荧光定量PCR和Western Blot分别检测α-SN在基因和蛋白水平表达的抑制效率,筛选出最佳shRNA靶序列,并结合流式分选,建立稳定转染该shRNA重组慢病毒载体的细胞株。(4)用最佳shRNA靶序列与不带绿色荧光蛋白的慢病毒载体pLKO.1重组并转染SH-SY5Y细胞,Western Blot检测α-SN蛋白水平的抑制效率。3.干扰α-SN表达后的SH-SY5Y细胞株的毒性损伤反应实验分6组,未转染的正常细胞对照组(CON)、空白载体对照组(Empty vector)、α-SN干扰组(RNAi)、CON给药组(CON+METH)、Empty vector给药组(Empty vector+METH)、RNAi给药组(RNAi+METH)。各组细胞分别接种于96孔板或6孔板或10cm培养皿,当细胞生长至80%汇合时,弃原培养液,处理组加入含3.5mmol/L METH的2%血清培养基,对照组换成等体积不含METH的2%血清培养基,细胞继续培养后,收集细胞或细胞培养液进行各项实验,检测以下项目：(1)倒置显微镜下观察各组细胞形态学损伤的变化、CCK-8法观察各组细胞细胞活力的变化。(2)实时荧光定量PCR检测各组细胞内TH、DAT、VMAT-2在基因水平的表达变化。(3) ELISA方法检测各组细胞内DA含量的改变。(4)酶化学方法检测ROS、NOS、NO的活性变化,分别用ROS荧光检测试剂盒、NOS活性检测试剂盒、NOS检测试剂盒检测。(5)通过Annexin V-FITC/PI双标记及流式细胞技术检测细胞的凋亡率；电子显微镜观察细胞超微结构的变化。(6)用Tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE)标记线粒体△Ψm(跨膜电位),结合激光扫描共聚焦显微镜检测各组细胞△Ψm的变化。(7)用Calcein标记技术结合共聚焦显微镜检测线粒体通透转变孔道(mitochondfial permeability transition pore, MPTP)开放的变化。(8)各组细胞与Fluo-3/AM共孵育,采用共聚焦显微镜观察细胞内钙离子荧光强度的变化。(9) Western blot技术检测各组细胞线粒体内和胞质内Cyt C的变化。结果：1.以未经METH处理的SH-SY5Y细胞为对照组,0.5～4.5mmol/L METH处理的SH-SY5Y细胞24h后倒置显微镜下可见胞体皱缩变圆,变圆细胞的胞质透亮度增加,可见环形透亮区,突起变短、断裂、消失,并可见细胞脱壁漂浮现象,且细胞损伤随METH浓度增加而呈增强趋势。CCK-8法测得SH-SY5Y细胞存活率随METH浓度增加逐渐降低,除0.5mmo1/L处理组与对照组相比无显著性差异(P=0.274)外,其他各浓度处理组与对照组相比均有显著性差异(P<0.001)。细胞凋亡率随METH浓度增加而逐渐增加,各浓度处理组与对照组相比均有显著性差异(P<0.001)。实时荧光定量PCR结果显示：与未经METH处理的对照组相比,0.5mmol/L处理组细胞中α-SN-mRNA的表达量没有显著差异(P=0.936),其它浓度METH处理组α-SN-mRNA均显著性上升(P≤0.001)。随着METH浓度增加,α-SN-mRNA表达量逐步上升。Western Blot也证实α-SN蛋白的表达随着METH浓度增加而逐步上升。2.筛选确认沉默效果最佳的shRNA,成功构建α-SN-shRNA-pLVTHM重组慢病毒载体,转染SH-SY5Y细胞,可抑制α-SN基因mRNA表达最高达到84%。用最佳shRNA与不带绿色荧光蛋白的慢病毒载体pLKO.1重组,获得稳定转染α-SN-shRNA-pLKO.1的细胞株。Western Blot实验证实上述两个RNAi细胞株中的a-SN蛋白表达均显著下降。3. Empty vector组(转染空白载体的细胞)、RNAi组(转染α-SN-shRNA的细胞)与CON组(未转染的细胞)相比,细胞活性均无显著性差异(P>0.05)。与未经METH处理的CON组细胞相比,3.5mmol/L METH处理的CON组可见大量死亡漂浮的细胞、细胞活性显著性下降(P≤0.001), DAI、TH、 VMAT-2mRNA表达显著性下降(P<0.001,P<0.001,P<0.001),细胞内DA含量显著下降(P≤0.001), ROS、NOS、NO水平显著性升高(P<0.001,P<0.001,P<0.001)。而RNAi+METH组与CON+METH组相比,镜下死亡漂浮的细胞减少、细胞活性显著性升高(P≤0.001)、DAT、TH、VMAT-2mRNA显著性回升(P<0.001,P<0.001,P<0.001),细胞内DA含量显著性回升(P≤0.001)、ROS、NOS、NO的表达水平显著性回落(P<0.001,P<0.001,P<0.001)。4.3.5mmol/L METH处理的CON组细胞早期凋亡率较未经METH处理的CON组细胞显著升高(P≤0.001)。其中RNAi+METH组早期凋亡率明显低于CON+METH组(P<0.001)。3.5mmol/L METH作用24小时后,对照组细胞电镜下可见：1)坏死的形态学特征：内质网、高尔基体等细胞器轻度空泡化,核溶解、核仁消失；2)早期凋亡细胞的形态学特征：胞体缩小,胞膜断裂,染色质凝聚成新月状,附着在核膜周边；3)吞噬了线粒体的自噬小体；4)发现多个类似路易小体、多层旋涡状排列的均匀物质。3.5mmol/L METH处理的RNAi组细胞电镜下未发现类似路易小体的结构,且坏死、凋亡、白噬等损伤变化较对照组明显减少。5.荧光标记结合激光扫描共聚焦显微镜观察发现：1)METH作用2小时后,TMRE标记检测显示给药处理后的细胞胞质内红色荧光强度较METH作用前减弱,但RNAi+METH组细胞胞质内荧光强度明显高于METH处理的正常细胞和空白载体组。表明METH可导致线粒体膜电位降低,而RNAi+METH组线粒体膜电位降低程度低于CON组,提示干扰α-SN表达可一定程度上抑制线粒体膜电位下降。2)Calcein和CoCl2标记检测发现METH作用后细胞胞质内绿色荧光强度明显减弱,表明METH使线粒体通透性转换孔道开放程度增加。RNAi+METH组线粒体通透性转换孔道开放程度低于CON组,说明干扰α-SN表达能够抑制线粒体通透性转换孔道开放。3)Fluo-3标记细胞质内游离钙离子显示METH作用后细胞胞质内绿色荧光强度明显增强,表明细胞内游离钙离子浓度增高,其中RNAi+METH组细胞内钙离子浓度增高程度显著低于CON组,说明干扰a-SN表达可抑制细胞外钙离子内流。6. Western Blot结果显示,METH处理正常细胞后线粒体内细胞色素C的含量明显降低,同时细胞浆内细胞色素C含量明显升高,但RNAi+METH组的线粒体内细胞色素C含量下降水平低于对照组,细胞浆内细胞色素C含量升高程度也低于对照组。结论1.METH可导致SH-SY5Y细胞形态学改变、细胞活力下降、细胞凋亡率增加以及α-SN基因和蛋白表达水平的增加。随着METH浓度升高,细胞损伤程度、α-SN的表达水平均呈增强趋势。2.成功构建靶向α--SN的重组shRNA慢病毒载体,并显著下调了SH-SY5Y细胞中a-SN基因的表达,获得稳定转染α-SN-shRNA的细胞株以供长期实验。3.干扰α-SN表达可抑制METH引起的细胞活力下降、TH、DAT、VMAT-2等基因水平下降、多巴胺耗竭和ROS、NOS、NO水平升高,可能是通过抑制上述多巴胺系统紊乱及氧化应激、硝化应激损伤,从而拮抗METH引起的细胞毒性。4.干扰α-SN表达能抵抗METH引起的线粒体△Ψm下降、MPTP开放、细胞外钙离子内流,抑制线粒体的细胞色素C释放进入胞浆,从而在一定程度上保护线粒体的正常功能、抵抗METH引起的细胞坏死和凋亡。