第一章活化TLR4对人脐血内皮祖细胞的影响及机制研究第一节人脐血两种类型内皮祖细胞体外分化研究目的:研究人脐带血中两种类型内皮祖细胞的体外分化特征。方法:采用6%羟乙基淀粉沉降法和密度梯度离心法联合分离脐带血中单个核细胞,在含有血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中培养。通过形态学、免疫荧光、逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)和流式细胞法分析细胞的生长特点和生物学特征。结果:贴壁细胞分为早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞两种类型细胞。早期内皮祖细胞的形态从小的圆形细胞变成以集落为中心,周围呈发芽式向外生长的细胞群,晚期内皮祖细胞形成典型的“铺路石样”。DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiL-acLDL)和FITC标记荆豆凝集素I(FITC-UEA-I)双染色阳性细胞初步鉴定为内皮祖细胞。RT-PCR提示随着培养时间延长,内皮特异性基因表达变化逐渐增强,流式细胞分析提示早期EPC有AC133、CD34、KDR表达;晚期EPCsAC133不表达,CD34表达弱,KDR表达增强。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法提示早期EPCs增值能力弱,而晚期EPCs增值能力强:结论:在人脐血中可培养出两种类型的EPCs,两种细胞在细胞表型、内皮特异性基因表达及细胞增殖能力方面存在明显的差异。为进一步研究EPCs提供实验基础。第二节活化TLR4诱导早期内皮祖细胞增殖的机制研究目的:研究Toll样受体(TLRs)在脐带血内皮祖细胞中的表达分析及脂多糖(LPS)对内皮祖细胞的影响;分析活化的TLR4对内皮祖细胞生长的作用及机制分析。方法:取体外培养的早期内皮祖细胞,在贴壁细胞中加入不同浓度(1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml,1000ng/ml)的LPS,采用RT-PCR及流式细胞分析法检测内皮祖细胞中TLRs及细胞因子的表达;细胞计数法检测细胞的数量变化;Annexin V-PI检测LPS作用下EPCs的凋亡情况;RT-PCR及流式细胞分析法检测EPCs细胞表面标记(AC133、CD34、KDR)的变化;Western blot检测LPS作用下信号传导通路中MAPK家族Erk、P38、核转录因子NF-κB的活化情况。结果:1、RT-PCR结果显示早期EPCs中表达除TLR7以外所有的TLRs,进一步流式细胞分析证实EPCs表面表达CD14、TLR2和TLR4。在LPS刺激下EPCs表达IL—8、IFN-α、IFN-β、TNFα。2、细胞计数法结果显示LPS(100ng/ml)作用下EPCs数量明显增加(P＜0.01);Annexin V-PI染色分析发现LPS对EPCs的凋亡没有影响。3、RT-PCR及流式细胞分析结果显示EPCs细胞表面标记AC133、CD34表达上调,而KDR表达无明显变化。4、Western blot结果显示LPS诱导TLR4信号传导中MAPK家族中Erk、P38、核转录因子NF-κB的磷酸活化。结论:1、发现早期内皮祖细胞表达有生物学活性的TLRs,而TLR4在内皮祖细胞中高表达。2、活化的TLR4不诱导细胞凋亡,而诱导内皮祖细胞生长。3、内皮祖细胞的生长是LPS通过激活TLR4信号通路,最终激活NF-κB和MAPK信号传导所致。第二章ADMA对人脐血内皮祖细胞的影响及机制研究第一节循环内皮祖细胞与ADMA在冠心病患者中的检测及相关性分析目的:探讨冠心病患者中循环内皮祖细胞与非对称性二甲基精氨酸(ADMA)的关系及临床意义。方法:50例冠心病患者均经选择性冠状动脉造影证实有明显的冠状动脉狭窄;30例对照组经临床检查和选择性冠状动脉造影排除冠心病。根据病变程度分组,测定各组患者血浆ADMA水平;采集研究对象外周血进行内皮祖细胞的分离培养,7—10天后倒置相差显微镜下计数细胞克隆形成单位(CFU)评估循环内皮祖细胞水平。结果:1、冠心病多支病变组血浆ADMA水平明显高于对照组(P＜0.01),Gensini积分≥60组血浆ADMA水平明显高于对照组;2、冠心病组中多支病变组循环内皮祖细胞水平明显低于对照组(P＜0.01);Gensini积分≥60组循环内皮祖细胞水平显著低于对照组(P＜0.01)。血清ADMA与循环内皮祖细胞水平呈负相关(r=-0.416,P＜0.01)。结论:1、随着冠心病病变程度的增加,体内ADMA浓度逐渐增加,而EPCs逐渐减少,冠心病的发生和ADMA的蓄积和EPCs的减少相关。2、体内ADMA浓度和EPCs的数量呈负相关,ADMA的增加可能导致循环EPCs数量的减少,ADMA通过何种机制影响体内EPCs的数量,尚待进一步研究。第二节ADMA对人脐血早期内皮祖细胞增殖影响及L-精氨酸的作用目的:研究非对称性二甲基精氨酸(ADMA)对人脐带血内皮祖细胞增殖的影响,观测L-精氨酸(L-arg)对ADMA的拮抗作用,并探讨其机制。方法:从脐带血中分离出单个核细胞,体外培养7天,在贴壁细胞中加入不同浓度的非对称性二甲基精氨酸(1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l)作用不同时间(24、48、72小时),用MTT比色实验和细胞克隆形成单位(CFU)计数的方法评价ADMA对EPCs增殖的影响;同时,加入L-精氨酸后采用MTT比色实验和高倍荧光显微镜下DiI-acLDL染色细胞计数法分析L-精氨酸对ADMA作用内皮祖细胞的影响;细胞随机分5组:对照组,ADMA组,ADMA+L-精氨酸组,ADMA+吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)组,L-精氨酸组。运用荧光染料检测细胞活性氧的产生。逆转录多聚酶链反应检测还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶亚基及细胞内抗氧化剂超氧化物歧化酶(MnSOD)mRNA变化。硝酸还原酶法测定培养液上清液一氧化氮(NO)的含量,采用化学比色法测定培养液上清液总一氧化氮合酶(NOS)活力。结果:1、ADMA呈量效和时效性的减少内皮祖细胞数目和增殖能力,抑制NOS活性,降低NO水平:2、随着L-精氨酸浓度的增加,L-精氨酸能有效拮抗ADMA对内皮祖细胞增殖的抑制作用,同样,L-精氨酸能通过拮抗ADMA,增强NOS活性,增加NO水平。3、ADMA显著增加细胞内活性氧的生成;L-精氨酸和抗氧化剂PDTC能抑制ADMA刺激后的细胞内活性氧产生。4、ADMA诱导NADPH氧化酶p22phox亚基、gp91phox亚基mRNA的表达明显上调,L-精氨酸和抗氧化剂(PDTC)能抑制这些基因的上调。5、ADMA对抗氧化酶MnSOD mRNA表达没有影响。结论:1、ADMA通过减少NO的生成,增加内皮祖细胞内活性氧生成,上调NADPH氧化酶表达,抑制人脐血内皮祖细胞的增殖,影响内皮祖细胞的内皮再生功能。2、外源性的L-精氨酸能拮抗ADMA对EPCs增殖的抑制作用,抑制细胞内氧化应激反应,起到保护内皮祖细胞的作用,从而保护内皮功能。3、ADMA诱导的细胞氧化应激反应和抗氧化酶MnSOD无关。