表达于NK细胞和部分T细胞表面的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer-cell immunoglobulin-like receptors, KIRs),与人类白细胞抗原(Human leukocycte antigens, HLA) I类分子组成受-配体复合物,共同调节NK细胞的活性,在肿瘤免疫、移植免疫、抗感染免疫中发挥重要作用。编码KIR分子的KIR基因家族位于人类第19染色体长臂上(19q13.4),包括了14种功能性框架基因(KIR2DL1-5、2DS1-5、3DL1-3、3DS1)和2种假基因(KIR2DP1、3DP1)。截至2013年10月公布的IPD-KIR Database (Release2.5.0), KIR基因家族的等位基因共发现有678个。KIR、HLA基因分子遗传多态性存在种族和地区的差异。以往的KIR群体遗传学研究侧重于采用PCR-SSP方法检测KIR框架基因的有无,研究报道KIR框架基因及KJR框架基因组合型的频率,没有研究KIR已知的配体及KIR-HLA基因型组合的多态性。在KIR与白血病的关联研究中,亦没有研究和探讨KIR分子的配体及KIR-HLA基因型组合对白血病发生的影响,由于病例来源、种族背景、样本数量及KIR框架基因检测方法的不同,所得到的结果存在着很大的差异并难以重复。KIR分子发挥激活或抑制作用,必须依赖于配体的存在。KIR框架基因特别是抑制性KIR框架基因多态性十分丰富。本文从KIR框架基因及其基因组合型、HLAⅠ类配体、已知的单个KIR+HLA受-配体组合及KIR-HLA基因型组合四个层次水平全面地研究南方汉族健康人群KIR系统分子遗传多态性,以所获得的基础数据开展了KIR系统分子遗传多态性与白血病的关联研究,并对与白血病相关的KIR框架基因从KIR等位基因水平进一步开展了K1R等位基因多态性与白血病的关联研究。本文的研究内容包含了三方面的工作：首先,从KIR框架基因及其基因组合型、HLA I类配体、已知的单个KIR+HLA受-配体组合及KIR-HLA基因型组合四个层次水平全面地研究南方汉族健康人群KIR系统分子遗传多态性。可为白血病、器官移植、自身免疫性疾病、病毒感染性疾病、生殖免疫等临床基础与应用研究提供基础数据和参考。本文检测了16个KIR框架基因,结构基因KIR3DL2、3DL3、3DP1和2DL4存在于所有的个体。框架基因KIR3DL1、2DL1、2DL3、2DS4和假基因2DP1最为常见,其检出频率均高于90%; KIR2DL2、2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS5和3DS1最为少见,其检出频率均低于40%。共发现有30种KIR基因组合型,表明在南方汉族人群中KIR基因组合的种类是有限的。KIRAA1基因组合型是最为常见的,占52.7%。在KIRAA1基因组合型个体中,有15.6%的个体携带无激活效应的KIR2DS4-deleted纯合子,该类个体不存在任何激活性KIR框架基因。KIR基因是以A或B单倍体的形式遗传,南方汉族健康人群以A单倍体为主,占74.8%。同为KIR2D分子的配体,HLA-C1比HLA-C2更为常见。HLA-B Bw4-80I、HLA-B Bw4-80T和HLA-A Bw4的检出频率大致相近,约为32%。已知的KIR+HLA受-配体组合中2DL2/3+C1(98.1%)、3DL1+Bw4(73.3%)和3DL2+A3/11(60.0%)最为常见,而3DS1+Bw4-80I最为少见,检出频率仅为9.4%。在受检者中共发现了193种独特的KIR-HLA基因型组合,其中有130种仅出现过一次。本文所获得的南方汉族健康人群"KIR-HLA基因型组合”可为临床移植、白血病等疾病关联研究提供重要的基础数据和参考。其次,基于所获得的南方汉族健康人群KIR系统多态性数据的基础上,以白血病为研究对象,开展了KIR系统分子遗传多态性与急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoid leukemia, ALL)、急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia, AML)、慢性髓细胞白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)的关联研究,为白血病的发病机制和个体化免疫治疗提供新的线索及理论依据。在ALL组中,KIR2DL3、配体HLA-C1及KIR2DL3+HLA-C1受-配体组合的检出频率均显著低于健康对照组,均为ALL保护因素(KIR2DL3:OR=0.302,95%CI=0.115-0.794, P=0.010; HLA-C1:OR=0.288,95%CI=0.117-0.708, P=0.004; KIR2DL3+HLA-C1:OR=0.463,95%CI=0.220-0.974, P=0.038)。在三种与HLA-C配体结合的抑制性KIR中,KIR2DL3+HLA-C1介导的抑制信号最弱,推测KIR2DL3+HLA-C1受-配体组合个体的KIR2DL3+NK细胞更容易被激活,能更好地发挥免疫清除功能。连锁遗传的2DS3-2DL5框架基因、3DS1+Bw4-80T受-配体组合的检出频率在ALL白血病患者中却显著高于健康对照组,均为ALL易感因素(KIR2DS3:OR=1.467, CI=1.038-2.703, P=0.030; KIR2DL5:OR=1.548,95%CI=1.033-2.320, P=0.033;3DS1+Bw4-80T:OR=1.731,95%CI=1.046-2.865, P=0.031)。KIR2DS3与2DL5是完全连锁不平衡的框架基因,但是由于配体尚未明确,其作用机制有待于进一步研究。在AML组中,KIR框架基因及其基因组合、]HLAⅠ类配体、单个KIR+HLA受-配体组合及KIR-HLA基因型组合的频率分布与健康对照组均无显著性差异。在CML组中,KIR2DL1的配体HLA-C2及KIR2DL1+HLA-C2、HLA-B Bw4-80I的检出频率均显著低于健康对照组,为CML保护因素(HLA-C2:OR=0.386,95%CI=0.240-0.620, P=0.000; KIR2DL1+HLA-C2:OR=0.316,95%CI=0.191-0.525, P=0.000; HLA-B Bw4-80I:OR=0.576,95%CI=0.384-0.862, P=0.007)。在三种与HLA-C1/C2配位的抑制性KIR2DL1-3中,KIR2DL1与HLA-C2的亲合力和介导的抑制能力最强。本研究中发现KIR2DL1的配体-HLA-C2的检出频率在CML组中显著降低,推测CML肿瘤细胞的HLA-C2分子表达机率降低,KIR2DL1+NK细胞受到的抑制信号相对减弱,激活信号相对增强,活化的NK细胞杀伤肿瘤细胞。KIR3DL1配体HLA-B Bw4-80I分子表达机率降低,抑制信号减弱,从而使NK细胞被激活,杀伤异常的肿瘤细胞。最值得注意的是：KIR-HLA基因型组合ID2(KIR3DL1-2DL1-2DL3-2DS4-2DL4-3DL2-3DL3-2DP1-3DP1-HLA-C1/C1-Bw6/Bw6-A3/11)在CML组的检出频率显著高于健康对照组,为CML易感因素(OR=2.163,95%CI=1.198-3.906, P=0.009).白血病肿瘤细胞可通过HLA Ⅰ类分子差异表达下调逃逸T细胞毒性作用及NK细胞监控。HLA-BBw6分子不是KIR的配体,]3LA-B Bw6表达水平的下调程度高于HLA-B Bw4分子,在CML组携带ID2KIR-HLA基因型组合的个体,均为HLA-B Bw6/Bw6纯合子,有利于肿瘤细胞逃逸T细胞毒性的作用。从检出的KIR框架基因组合型及已知HLA配体来看,KIR-HLA基因型组合ID2中2DL3+HLA-C1和3DL2-HLA-A3/11均介导抑制信号,但同时也存在传递激活信号的KIR2DS4,因KIR2DS4的配体尚不明了,无法检测2DS4的配体存在与否。鉴于NK细胞活性调控的复杂性,难以预测KIR-HLA基因型组合ID2中NK细胞的活性状态。本文CML组中KIR-HLA基因型组合ID2表现为易感作用,我们推测有三种可能原因：一是CTL效应受到抑制；二是NK细胞杀伤功能受到抑制,但有待于NK细胞杀伤功能实验进行验证；三是NK细胞杀伤功能、CTL效应及其它机制共同引起的,还有待于进一步研究。最后,鉴于KIR2DL3及KIR2DL3+HLA-C1为ALL保护因素,同一个框架基因中的不同等位基因,其膜表达水平、介导的激活或抑制能力也存在差异,为此,本文研究和建立了KIR2DL3基因测序分型方法,从等位基因水平进一步研究KIR2DL3分子遗传多态性与ALL白血病的关联。本文通过KIR2DL3基因测序分型,在健康对照组中总共发现了15个KIR2DL3等位基因,其中KIR2DL3*00101频率最高(71.8%),其次为KIR2DL3*00201(13.1%)；在ALL病例组中检出了8个等位基因。KIR2DL3*00101、*00201、*015和*023在两组中均有发现,且KIR2DL3*00101、*00201和*023等位基因频率在两组中均大于1%。在健康对照组及ALL病例组中共检出了4个已获得WHO KIR命名委员会正式命名的新等位基因,其中KIR2DL3*00109为同义突变,KIR2DL3*030、*031、*032为非同义突变。新等位基因KIR2DL3*00109与KIR2DL3*00101最接近,差异在于第5外显子CDS nt478C>T引起的同义突变；KIR2DL3*030与KIR2DL3*00101最接近,差异在于第4外显子CDS nt201G>C引起的非同义突变,导致第139位氨基酸残基发生取代(Lys>Asn); KIR2DL3*031与KIR2DL3*00101最接近,差异在于第7外显子CDS nt735T>C引起的同义突变和CDS736G>A引起的非同义突变,导致第225位氨基酸残基发生取代(Val>Ile); KIR2DL3*032与KIR2DL3*00101最接近,差异在于第7外显子CDS nt754G>C引起的非同义突变,导致第754位氨基酸残基发生取代(Val>Leu)。通过KIR2DL3等位基因频率的组间比较,发现KIR2DL3*00201在ALL组中的频率显著低于健康对照组(OR=0.606,95%CI=0.375-0.980, P=0.040),为ALL保护性基因。与其它KIR2DL3等位基因相比,KIR2DL3*00201不仅在NK细胞表面表达水平较低,与配体HLA-C1的亲合力及介导的抑制作用均为最弱,我们推测,这可能是导致KIR2DL3*00201+NK细胞克隆更容易被活化并杀伤肿瘤细胞、更好地发挥免疫清除功能和保护性作用的原因。此外,本文首次建立的KIR2DL3基因测序分型方法的具有以下特点：一是在同一反应体系和循环参数条件下进行KIR2DL3基因特异性PCR扩增及测序分型,并采用简便、可靠的磁珠法对PCR产物进行纯化,适合于高通量化：二是涵盖了KIR2DL3基因全部外显子,减少了模棱两可结果,可确定到KIR2DL3等位基因前5位数;三是分别对KIR2DL3各个外显子进行双向测序,所获得的碱基序列无背景信号和杂峰,易于识别和结果判读；四是KIR2DL3特异性PCR扩增结果与进口的商品化KIR-SSP试剂盒进行了平行对照,取得了完全一致的结果即本文设计的PCR扩增引物亦可用于鉴定KIR2DL3框架基因的有无。本文的KIR2DL3测序分型方法为试剂商品化和国产化奠定了基础,在免疫遗传领域具有重要的应用价值。