黑肩绿盲蝽Cyrtorhinus lividipennis属半翅目,盲蝽科,是热带和温带地区水稻上重要的捕食性天敌。其猎物范围广泛,可捕食褐飞虱Nilaparvatalugens、白背飞虱Sagatella为rayfea、灰飞虱Laodelphax striatellus、黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps的卵和低龄若虫。化学防治是稻田害虫防治最常用的方式。黑肩绿盲蝽可能因接触到水稻植株上残留的农药、取食带农药的猎物等途径接触到亚致死剂量的杀虫剂。本实验室前期的研究发现亚致死浓度溴氰菊酯、三唑磷、吡虫啉处理导致黑肩绿盲蝽产卵量显著提高。然而,杀虫剂刺激黑肩绿盲蝽的生殖调控机制至今不清楚。本论文研究了亚致死浓度吡虫啉刺激黑肩绿盲蝽生殖的激素调控机制。主要结果如下:1通过转录组数据鉴定和分析了黑肩绿盲蝽响应亚致死浓度杀虫剂处理的相关基因通过对亚致死浓度(LC20)的3种杀虫剂(溴氰菊酯、吡虫啉及三唑磷)处理黑肩绿盲蝽雌雄虫的转录组测序,筛选获得差异表达基因,继而对其进行GO功能注释并分类富集。首先,分析了三种亚致死浓度杀虫剂处理黑肩绿盲蝽雌雄虫与对照组(丙酮处理)的基因表达差异,结果显示与丙酮处理的雌虫(Control F)相比,溴氰菊酯处理的雌虫(Deltamethrin F)中有377个基因上调,244基因下调;吡虫啉处理的雌虫(Imidacloprid F)中有560个基因上调,309基因下调;三唑磷处理的雌虫(Triazophos F)中有472个基因上调,252基因下调。与丙酮处理的雄虫(Control M)相比,溴氰菊酯处理的雄虫(Deltamethrin M)中有15061个基因上调,3650基因下调;吡虫啉处理的雄虫(Imidacloprid M)中有16984个基因上调,5651基因下调;三唑磷处理的雄虫(Triazophos M)中有9358个基因上调,2232基因下调。三种杀虫剂处理后雄虫的差异基因数量显著大于雌虫。其次,注释和分类了差异表达基因的功能,发现筛选出的差异基因功能分成三大类:生物学过程(Biology Process)、细胞成分(cellular component)以及分子功能(molecular function),其中具有生物学过程功能的差异基因超过45%。最后,将差异基因富集到KEGG通路,结果表明亚致死浓度的溴氰菊酯、吡虫啉和三唑磷三种杀虫剂处理诱导黑肩绿盲蝽体内激素、生殖、能量代谢等多种生物学途径相关基因表达。特别令人注意地是吡虫啉处理雌雄虫和三唑磷处理雄虫体内的差异基因显著地聚集于昆虫的激素途径,包括保幼激素信号通路和类胰岛素神经肽信号通路,并且通过对差异激素基因JHAMT的定量证实了转录组的准确性。因此,本文转录组结果提示保幼激素和类胰岛素神经肽通路在杀虫剂调控昆虫生殖中起关键作用。2解析了保幼激素对黑肩绿盲蝽生殖的调控作用及其在亚致死浓度吡虫啉刺激黑肩绿盲蝽生殖中的作用采用RACE PCR技术获得全长为1423 bp的黑肩绿盲蝽保幼激素酸甲基转移酶基因ClJHAMT(Genbank ID:MG996442)、全长 2230bp 的保幼激素酯酶基因ClJHE(Genbank ID:KY701514)。采用RNAi技术(显微注射dsRNA)沉默ClJHAMT、ClJHE的表达,两个基因的相对表达量分别下降了 95.0%、96.1%。沉默ClJHAMT后,黑肩绿盲蝽卵黄原蛋白基因ClVg相对表达量下降了 88.8%,雌虫产卵量降低了 41.5%;沉默ClJHE后,黑肩绿盲蝽卵黄原蛋白基因ClVg相对表达量上升了 275.0%,但雌虫的产卵量无显著变化,表明保幼激素可以通过调控黑肩绿盲蝽卵黄原蛋白基因的表达继而调控产卵。亚致死浓度(LC20)吡虫啉处理黑肩绿盲蝽,羽化后12h,处理组ClJHAMT和ClJHE的相对表达量与对照组(丙酮)相比,分别提高了 218.5%和101.1%,而羽化后36h,这两个基因的相对表达量在各处理组间无显著差异;同时经测定,羽化后24 h和48 h,处理昆虫体内保幼激素滴度分别达到88.3 ng/L和93.3 ng/L,相较于对照组(丙酮)提高了 35.3%和60.6%。进一步比较了吡虫啉+沉默GFP双处理、沉默ClJHAMT处理以及吡虫啉+沉默ClJHAMT双处理的雌虫的产卵前期、产卵量和卵孵化率,发现各处理间产卵前期、卵孵化率无明显差异,吡虫啉+沉默ClJHAMT双处理组的产卵量较沉默ClJHAMT单一处理的增加了 107.4%,比吡虫啉+沉默GFP双处理的减少了 21.4%。同样,比较了吡虫啉+沉默GFP双处理、沉默ClJHE处理以及吡虫啉+沉默ClJHE双处理对黑肩绿盲蝽雌虫生殖力的影响,发现吡虫啉+沉默ClJHE双处理的产卵量比沉默ClJHE单一处理的提高了 43.7%,但与吡虫啉+沉默GFP双处理的相比无明显差异。以上研究表明亚致死浓度吡虫啉处理导致黑肩绿盲蝽体内保幼激素相关基因表达上升、保幼激素滴度上升、继而促进了其产卵。3明确了类胰岛素神经肽对黑肩绿盲蝽生殖的调控作用及其参与亚致死浓度吡虫啉刺激黑肩绿盲蝽生殖的可能性用RACE PCR技术克隆获得了全长1709 bp类胰岛素神经肽受体基因ClInR(Genbank ID:MG996441)。采用RNA干扰技术沉默ClInR基因的表达,ClInR相对表达量显著下降了80.6%。干扰ClInR后,黑肩绿盲蝽卵黄原蛋白基因ClVg相对表达量显著降低了 92.1%,产卵量降低了 53.9%。表明类胰岛素神经肽参与了黑肩绿盲蝽的生殖调控。进一步通过qRT-PCR方法定量检测,发现干扰类胰岛素神经肽相关基因ClInR的表达并不影响保幼激素相关基因(ClJHAMT和ClJHE)的相对表达量。干扰保幼激素相关基因(ClJHAMT或ClJHE)的表达并不影响类胰岛素神经肽相关基因(ClInR、ClAKT)的相对表达,表明黑肩绿盲蝽保幼激素和类胰岛素神经肽信号传导途径对生殖的调控无协同作用。亚致死浓度吡虫啉处理黑肩绿盲蝽,羽化后24 h和48 h,处理组体内类胰岛素神经肽滴度较对照组(丙酮)分别提高了 37.5%和105.8%。综合亚致死浓度杀虫剂处理引起类胰岛素神经肽滴度上升、产卵量提高以及类胰岛素神经肽对黑肩绿盲蝽的生殖调控作用,推测类胰岛素神经肽参与了亚致死浓度吡虫啉刺激黑肩绿盲蝽的生殖调控,具体的调控机制待进一步研究。