研究背景和目的:先天性心脏病（congenital heart disease,CHD）是新生儿常见的重大出生缺陷,是导致围产儿死亡和儿童死亡的主要原因。研究证实,CHD主要由于胚胎时期遗传与环境因素共同作用引起,其中遗传因素具有重要作用。心脏发育相关基因及信号通路与CHD关系的机制仍不明确。心脏发育过程为多基因共同调控的极复杂的生物学过程。研究表明转录因子可通过直接或间接调控靶基因的表达,而影响心肌细胞的迁移、增殖及分化,从而参与心脏发育及CHD的发生。TBX1基因是T-box基因家族成员之一,在胚胎发育早期表达,与心脏发育密切相关,是CHD的致病基因之一。目前,对TBX1基因的研究多集中于TBX1基因编码区的核苷酸变异或基因缺失和重复,而关于TBX1基因表达异常调控的研究较少。本课题组前期研究发现TBX1基因T350M多态性与法洛氏四联症（TOF）具有明显的相关性,可能是TOF的遗传易感基因。课题组首次发现CHD患者心肌组织中ACTC1基因表达水平降低,该异常可诱导胚胎发育时期心肌细胞过度凋亡,从而导致人类CHD的发生。课题组进一步研究发现ACTC1上游调控序列中存在HOXA3转录因子结合位点,转录因子HOXA3与TBX1相互作用参与心脏发育,与CHD的发生密切相关。胚胎早期发育过程中,凋亡相关的心肌细胞缺失是导致CHD发生的关键因素之一,与心肌细胞凋亡相关的基因调控异常可能是影响CHD发生的原因之一,其确切机制亟待研究。TBX3基因参与胚胎早期多器官发育,研究表明,TBX3基因可抑制细胞周期调节蛋白P21表达,从而发挥调控细胞周期、抑制细胞凋亡、促进增殖的作用。P21基因为周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）家族的抑制剂,在调节细胞周期和细胞增殖过程中发挥关键作用,而其在心肌细胞中的作用尚未见报道。因此,有必要深入探讨TBX1基因下游心脏发育相关的差异表达基因,以及TBX3基因是否作为TBX1基因下游信号分子通过P21基因调控心肌细胞生物学功能。进一步阐明TBX1基因参与心脏发育信号通路的分子机制,有助于探索新的先天性心脏病产前诊断靶点,并为先天性心脏病靶向治疗提供新的理论依据。研究方法:第一部分:采用TBX1 siRNA转染大鼠胚胎心肌细胞H9C2细胞,利用高通量基因芯片技术,筛选TBX1基因下游心脏发育相关的差异表达基因,进行GO富集分析和KEGG数据库Pathway富集分析;Real-time PCR和ELISA方法验证TBX3基因在CHD心肌组织中的mRNA和蛋白表达情况。第二部分:建立TBX3基因沉默和过表达H9C2细胞,Real-time PCR和Western blot检测TBX3基因mRNA和蛋白表达;采用CCK-8和Ki67免疫荧光染色检测细胞活性;流式细胞术检测细胞周期分布,Western blot检测周期蛋白CyclinA,CyclinB1,CyclinD1表达;利用Hoechst33342染色和Annexin V/PI双重染色法检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白cleaved PARP、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2表达;Jc-1法检测线粒体膜电位、试剂盒法检测线粒体ATPase活性和ROS含量;采用Real-time PCR和Western blot检测P21基因mRNA和蛋白表达,ChIP实验验证TBX3基因对P21的调控作用。最后,通过同时敲减TBX3基因和P21基因,检测P21基因对TBX3基因沉默诱导的P21基因表达和细胞增殖的影响。结果:第一部分:1.TBX1基因下游差异表达的基因995个,其中上调基因240个,下调基因755个。2.GO富集分析显示,上调差异表达基因富集度较高的生物学过程主要为:糖酵解过程、胆固醇合成、碳水化合物磷酸化、细胞迁移和脂质磷酸化等。与心脏相关的生物学过程包括:心脏瓣膜发育和心脏形态发生,相关的差异基因包括:Tgfb2、Sox9、Tab1。下调差异表达基因富集度较高的生物学过程主要为:细胞分化、染色体分离、有丝分裂细胞周期和对病毒的反应等。与心脏相关的生物学过程包括:心脏形态发生、胚胎心管形成、胚胎心导管左/右模式形成、心率调节以及心脏发育等,相关的差异基因包括:TBX3、Cited2、Tead2、Pln、Casq2、Dmd、Ift122、Kcne2、Dchs1、Nrp2、Gli2。3.KEGG数据库Pathway富集分析表明,差异基因中具有统计学意义的信号通路主要有:细胞周期、胞质DNA传感通路、减数分裂等。4.在CHD心肌组织标本中TBX3基因mRNA和蛋白表达水平著降低。第二部分:1.敲减TBX3基因明显抑制H9C2细胞增殖活性和Ki67蛋白表达;过表达TBX3基因作用相反。2.敲减TBX3基因显著增加G1期H9C2细胞数,减少S期H9C2细胞数,抑制Cyclin D1,Cyclin A和Cyclin B1表达;过表达TBX3基因可以增强细胞周期蛋白表达,对细胞周期分布无显著影响。3、TBX3基因沉默H9C2细胞表现出典型的凋亡形态特征,包括核碎裂和染色质浓缩,凋亡细胞百分比明显增加,cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP、Bax表达上调、Bcl-2表达下调;过表达TBX3基因对细胞的凋亡状态无显著影响。4.敲减TBX3基因可显著下调H9C2细胞线粒膜电位和ATPase活性,增加ROS含量,并且增加胞质中细胞色素C含量,降低线粒体中细胞色素C含量。5.TBX3基因沉默使H9C2细胞中P21基因mRNA和蛋白表达水平显著升高,且TBX3蛋白与P21基因DNA存在靶向结合。6.同时敲减TBX3基因和P21基因使H9C2细胞中P21蛋白表达显著降低,并可明显恢复TBX3基因沉默诱导的H9C2细胞增殖能力的下降。结论:1.TBX1基因下游上调差异基因可能与生物合成和磷酸化反应等有关,下调差异表达基因可能与细胞分化、细胞周期和对某些生化物质的反应等有关;与心脏相关的生物学过程包括:心脏形态发生、胚胎心管左右模式形成、心脏左/右不对称发育、心率调节和心脏发育等。2.TBX3基因是TBX1基因下游心脏发育相关的基因。3.TBX3基因表达下调与CHD的发生相关。4.TBX3基因沉默抑制H9C2细胞增殖,使细胞周期阻滞于G1期。5.TBX3基因沉默诱导H9C2细胞线粒体功能障碍,促进细胞凋亡。6.P21基因是TBX3基因的下游靶基因。7.TBX3基因表达下调通过靶向调控P21基因的表达而抑制H9C2细胞增殖。