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具有促进胰岛素分泌、降低胰岛素抗性生物活性的物质—4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)在治疗糖尿病方面有潜在的应用价值。前期研究中,将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT 1520中异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)编码基因ido在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)L-异亮氨酸(L-isoleucine,Ile)生产菌株SN01中克隆和表达,构建出的重组菌株可以将内源Ile转化为4-HIL。本研究通过对代谢途径分析,进行代谢途径改造,进一步提高4-HIL产量。主要研究结果如下:(1)为了提高底物Ile的供应量,过表达ilvA构建了ido-ilvA表达菌SZ02。摇瓶发酵144 h后,4-HIL产量是10.68±0.10 mmol/L,而ido单表达菌株SZ01中4-HIL产量是52.79±1.04 mmol/L,SZ01和SZ02中4-HIL和Ile总产量分别是60.39±0.33 mmol/L和114.60±0.24 mmol/L,Ile到4-HIL的转化率分别是87%和9%。这说明ilvA的过表达提高了4-HIL和Ile的总浓度,但不利于Ile到4-HIL的转化。(2)为了提高底物α-酮戊二酸(α-KG)的供应量,过表达lgox和cat构建了ido-lgox表达菌SZ03和ido-lgox-cat表达菌SZ04。摇瓶发酵120 h后,SZ03和SZ04中4-HIL的产量分别是5.15±0.03 mmol/L和16.81±0.30 mmol/L,明显低于ido单表达菌株SZ01(46.36±1.82 mmol/L)。与SZ03相比,SZ04中4-HIL产量较高,说明lgox和cat的共表达能够部分缓解lgox单表达的不足。(3)为了提高草酰乙酸的回补量,过表达mqo构建了ido-mqo表达菌SZ05。在发酵144 h后,SZ05中4-HIL的产量是60.86±2.24 mmol/L,略低于ido单表达菌SZ01(72.06±5.60 mmol/L);Ile的产量是101.39±2.20 mmol/L,大幅高于SZ01(5.00±1.43mmol/L),最终SZ01和SZ05中Ile到4-HIL的转化率分别是94%和38%。通过对SZ05代谢途径中部分关键基因的RT-PCR分析表明,进入TCA循环的碳流由异柠檬酸裂解酶分流,进入乙醛酸循环,导致IDO酶促反应中另一底物α-KG供应不足和Ile过剩。通过在SZ05的发酵中添加α-KG,提高了4-HIL产量和转化率。(4)为了提高氧气的供应量,过表达vgb构建了ido-vgb表达菌SZ06。SZ06的IDO比酶活略高于ido单表达菌株SZ01。发酵144 h后,其OD和4-HIL产量分别是91.3和108.10±9.91 mmol/L,与SZ01相比,过表达vgb后,菌浓提高了13%,4-HIL产量提高了50%。(5)为了同时提高氧气和草酰乙酸或Ile的供应量,过表达vgb和mqo或ilvA构建了ido-mqo-vgb表达菌SZ07和ido-vgb-ilvA表达菌SZ08。在发酵144 h后,两株重组菌长势缓慢,SZ08几乎不产4-HIL,SZ07中4-HIL的产量仅为30.52±1.21 mmol/L,明显低于vgb表达菌SZ06(98.57±3.44 mmol/L)。SZ07和SZ08的胞内α-KG含量均低于SZ06。这说明vgb和mqo或ilvA的共表达不利于菌株生长,且由于α-KG供应不足,导致Ile到4-HIL的转化率降低,4-HIL合成能力降低,其原因需要进一步探究。