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嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)是人和多种动物的病原菌,其外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)具有良好的免疫原性。1.根据已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白A(OmpA)基因序列设计一对引物,PCR检测18株嗜水气单胞菌ompA分布情况,然后将J-1株、Y-65株及SPS-104株的ompA基因进行克隆测序。PCR检测结果表明15株扩增出目的片段。测序分析发现,3个克隆的基因片段均为948bp,编码316个氨基酸。与NCBI上登录的序列相比,同源性在93.1%-95%之间,缺失4个氨基酸。其中J-1株和SPS-104株的ompA基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为99.2%和98.1%,氨基酸缺失的位置一致;AhJ-1株和Y-65株ompA基因的核苷酸和氨基酸序列88.7%和89.6%,氨基酸缺失的位置相似。用DNA Star Protean进行的抗原性和表面结构域预测表明,与5株国内外气单胞菌参考株的抗原性比较,抗原位点分布基本一致,说明OmpA蛋白很可能为气单胞菌属共有的保护性抗原。2.将扩增得到的去除信号肽序列J-1株的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段,定向克隆至表达质粒pET32a(+)中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明插入片段长度为948bp,与NCBI上登录的序列相比,同源性为93.1%~95%,缺失4个氨基酸。将重组原核表达质粒pET32a-ompA转化至大肠杆菌BL2l(DE3),经诱导可表达分子量约57.4kD的蛋白,凝胶薄层扫描显示OmpA在转化菌中表达量占全菌蛋白的50%以上。用兔抗J-1株总外膜蛋白的血清进行Western blot,在57.4kD处有明显反应条带。融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA效价达1∶12800以上。Western blot检测结果显示,该血清与9株具有代表性的气单胞菌的约35kD的外膜蛋白均有较强反应,说明所表达的融合蛋白不仅保持原有外膜蛋白的免疫原性,而且提示OmpA可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。3.为了能在一个启动子的控制之下,既表达抗性筛选标记,又能表达表位抗原OmpA蛋白,本试验自行设计两对引物,应用重组PCR技术,先分别以pSK-H4-I-neo和嗜水气单胞菌J-1株为模板,获得抗性基因neo和外膜蛋白基因ompA,再通过重叠延伸的方法,将两个基因通过一疏水性柔性多肽接头(Gly4Ser)3碱基序列进行前后拼接,构建neo-GS-ompA融合基因。并以此融合基因取代pSK-H4-I-neo质粒中的neo基因,从而构建一个拟在四膜虫体内表达外膜蛋白OmpA的表达质粒pSK-H4-I-neo-GS-ompA。序列分析表明neo、ompA及linker拼接组合的顺序、方向及序列完全正确。质粒的正确构建为下一步转化四膜虫奠定基础。4.本试验首先摸索了四膜虫最佳电击时间,然后将适于四膜虫的基因表达载体pSK-H4-I-neo-GS-ompA及其酶切后获得的整个编码区的线性插入片断,在不同的缓冲液、电压及电容的组合下,电击转化到嗜热四膜虫接合株体内进行同源重组,以期在虫体内同时表达抗性基因neo和抗原基因ompA。结果:将四膜虫BF-1和BF-5分别在37℃静置饥饿22h时后混合,混合6h后开始接合,混合后7-8h接合对数达到高峰,此时为电击转化的最佳时间;接合期的虫株比正常状态的要小一些。pSK-H4-I-neo-GS-ompA及插入片断电击后均未获得抗性虫株,抗性基因neo未得到表达,可能是ompA基因中含有较多四膜虫的稀有密码子所致,需优化密码子后再表达。