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软骨发育不全是一种常染色体遗传病,是人类侏儒最常见的类型,其发生主要是De novo基因突变的结果,目前尚无有效的治疗方法。软骨发育不全主要影响四肢骨、椎骨等长骨(Long Bone)的软骨内成骨(Endochondral Ossification)过程,尤其是软骨生成(Chondrogenesis)过程,包括间充质细胞集聚并分化为软骨细胞,以及随后软骨细胞的增生、肥大和凋亡,但其机制目前并不完全清楚。*骺生长板软骨细胞增生与分化的调控,对长骨的纵向生长和骨骼的发育至关重要。长骨生长板受多种信号分子的调控,其中成纤维细胞生长因子及其受体(Fibroblast Growth Factors/Fibroblast Growth Factor Receptors,FGFs/FGFRs)在其中起重要作用。目前认为,通过非配体依赖的自主激活,FGFR3的十多种功能增强型(Gain-of-function)点突变可引起多种人类软骨发育障碍性侏儒,包括软骨发育不全(Achondroplasia, ACH)、季肋发育不全(Hypochondroplasia, HCH)、致死性骨发育不全(Thanatophoric Dysplasia, TD)和严重软骨发育不良伴发育迟缓和黑棘皮症(Severe Achondroplasia with Developmental Delay and Acanthosis Nigricans,SADDAN)等,其中95%以上的软骨发育不全患者由FGFR3的功能增强型突变引起。Deng等发现,FGFR3基因敲除小鼠(FGFR3-/-)有长骨过度生长、生长板增生软骨细胞带和肥大软骨细胞带变宽、软骨细胞增殖活性增加;相反,Chen等人利用基因敲入技术建立了模拟人ACH的FGFR3G369C点突变小鼠模型(相当于人源FGFR3G375C),这种小鼠FGFR3功能增强,个体明显短小,头颅短圆,长骨生长板组织形态结构异常,软骨细胞增生带短稀,增生能力减弱、肥大软骨细胞明显减少伴Collagen X表达减低(即软骨细胞分化能力降低),表明FGFR3是长骨软骨生成的负性调节分子,影响软骨细胞的增殖活性和分化。目前研究FGFR3突变引起的软骨发育异常主要集中于STAT1/p21和ERK-MAPK信号通路上,但抑制此两条信号通路,并不能完全缓解FGFR3突变所致的侏儒表型,提示可能存在其他信号通路参与了对软骨发育异常的调控。越来越多的研究表明PI3K/AKT信号通路在哺乳动物骨骼发育和细胞增殖分化中起重要作用,成纤维细胞生长因子(FGFs)、胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factors,IGFs)、胰岛素等对软骨发育和功能重要的生长因子均能激活该通路。PTEN,即第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN),是PI3K/AKT通路中一个重要的负性调控分子。研究发现在小鼠成-软骨前体细胞中敲除PTEN后影响生长板软骨细胞的增殖与分化。但是,该通路在FGFR3介导的软骨发育不全中的作用目前尚不清楚,需要进一步研究。鉴于FGFR3在软骨发育不全致病机理中的地位以及PI3K/AKT活性在软骨细胞增生抑制和分化延迟中的重要作用,本研究采用条件性基因敲除技术建立了软骨细胞条件性敲除PTEN基因的FGFR3功能增强型点突变小鼠模型,通过分析相关小鼠的表型,观察在FGFR3功能增强型小鼠软骨细胞特异性敲除PTEN基因后对软骨发育的影响,并初步探讨PTEN基因敲除影响软骨发育的可能的分子机制。主要实验方法1.利用基于Cre/LoxP系统的条件性基因敲除技术,建立了软骨细胞特异性敲除PTEN基因的FGFR3功能增强型小鼠模型,PCR鉴定小鼠基因型及免疫荧光鉴定敲除效率;2.采用X线摄影、全骨架染色和头颅局部摄影,观察小鼠大体形态及颅底软骨联结的变化情况,测定小鼠生长过程中体重、体长、躯干长、尾长和尾椎椎体长度的变化;3.制备了不同年龄不同基因型小鼠的组织切片,通过HE染色,观察生长板形态和第二骨化中心的发育情况;通过BrdU掺入后免疫组化检测,观察生长板软骨细胞增殖情况;4.采用定量PCR检测软骨分化相关基因COL2A1、COL10A1和IHH的表达情况;Western Blot检测p-AKT水平,激光共聚焦显微术检测了软骨组织中p-AKT的水平并进行了定位观察;5.建立胎鼠胫骨及跖骨体外培养模型;采用bpV处理阻断PTEN,观测对跖骨生长率的影响。主要实验结果一、软骨细胞特异性敲除PTEN基因的FGFR3功能增强型小鼠的获得利用FGFR3功能增强点突变小鼠(Fgfr3G369C/+小鼠,即ACH小鼠),Ptenflox/flox小鼠以及软骨细胞中特异表达Cre重组酶的转基因小鼠(Col2αCre小鼠)设计交配策略,获得了基因型为Col2aCre:Ptenflox/flox:ACH的小鼠。该小鼠为软骨细胞特异性敲除PTEN基因的FGFR3功能增强型小鼠。采用免疫荧光化学对该小鼠软骨细胞中PTEN的表达情况进行了鉴定,证实PTEN在软骨细胞中因为基因敲除而表达显著降低。二、PTEN基因敲除对ACH小鼠一般生长情况的影响1.PTEN基因敲除对ACH小鼠体重、体长、尾长、椎体长度的影响:①在观测期3-10w内,CAP小鼠体重增长较AP小鼠明显;②4w的CAP小鼠体长、尾长明显长于AP小鼠,但是两者椎体长度差异不显著。2.PTEN基因敲除对ACH小鼠头颅及颅底软骨联结的影响:①CAP小鼠头颅圆钝的状况较AP小鼠有所改善;②CAP小鼠的颅底软骨联结闭合时间较AP小鼠延迟。三、PTEN基因敲除对ACH小鼠软骨内成骨的影响1.PTEN基因敲除对ACH小鼠软骨细胞增殖的影响:出生5d和14d小鼠BrdU掺入检测后发现,CAP小鼠软骨细胞增殖指数较AP小鼠高,提示:CAP小鼠软骨细胞增殖活性较AP小鼠高;2.PTEN基因敲除对ACH小鼠软骨细胞分化的影响:观察出生7d、12d小鼠的生长板,发现CAP小鼠的第二骨化中心较AP小鼠的提前出现,16d时CAP小鼠生长板软骨细胞未增殖带明显较AP小鼠窄,提示:CAP小鼠软骨细胞分化较AP小鼠快;3.荧光定量PCR结果显示:7d时,AP小鼠关节软骨中COL2A1 mRNA比CAP小鼠高,CAP小鼠COL10A1 mRNA表达较AP小鼠高,提示CAP小鼠软骨细胞分化较AP小鼠加快。4.PTEN基因敲除对ACH小鼠产生影响的可能机制:AP小鼠软骨组织未检测到p-AKT,而CAP小鼠p-AKT水平显著高于AP小鼠,提示:敲除PTEN后对ACH小鼠增殖与分化产生的影响可能是由于AKT磷酸化水平改变引起。四、胎鼠胫骨体外培养模型的建立及阻断PTEN后对胎鼠跖骨生长的影响建立了ACH胎鼠(E16.5)胫骨体外培养7d,14d的模型,显示ACH胎鼠胫骨生长率较野生慢。ACH胎鼠(E16.5)跖骨在给予不同浓度bpV后结果显示:处理组跖骨生长率明显较未处理组高,提示:给予bpV处理阻断PTEN后,PI3K/AKT通路活化,促进了软骨的生长。主要结论通过上述实验结果分析,我们发现小鼠软骨细胞特异性敲除PTEN基因可部分缓解由FGFR3功能增强型点突变所引起的侏儒表型。主要表现为:1.软骨细胞特异性敲除PTEN的FGFR3功能增强型小鼠大体表型较FGFR3功能增强型小鼠有所缓解;2.软骨细胞特异性敲除PTEN的FGFR3功能增强型小鼠生长板软骨细胞增殖活性较FGFR3功能增强型小鼠增高,提示PTEN基因的条件性敲除,可以缓解FGFR3功能增强所致的软骨细胞增殖抑制;3.软骨细胞特异性敲除PTEN的FGFR3功能增强型小鼠生长板软骨细胞较AP小鼠软骨细胞分化加快,提示PTEN基因敲除可缓解FGFR3功能增强所致的分化抑制;4.PI3K/AKT信号通路在软骨发育中发挥重要作用,AKT活性降低是FGFR3功能增强所致软骨细胞增殖抑制和分化延迟的重要机制之一。进一步地采用bpV处理ACH胎鼠跖骨也发现阻断PTEN使PI3K/AKT通路活化,促进了软骨的生长。但是,FGFR3功能增强所致软骨细胞中AKT活性降低的机制尚需进一步研究。