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球孢白僵菌是最常见的虫生真菌之一,其寄主范围广,易大量生产,已开发为真菌杀虫剂在害虫生物防治中广泛应用。然而,球孢白僵菌和其它虫生真菌一样,具有杀虫慢的重大缺陷。为此人们一直在潜心研究虫生真菌的分子致病机制,以寻找可通过基因工程手段进行改造的基因。几丁质酶在虫生真菌穿透寄主体壁的过程中起一定作用,但其与真菌毒力的关系尚不清楚。本研究将外源的球孢白僵菌几丁质酶基因Bbchit1分别转入两个出发菌株:含有该基因的球孢白僵菌野生型菌株RCEF0013,以及将北非蝎(Androctonus australis)昆虫特异性神经毒素多肽基因AaIT转入RCEF0013后获得的一价转基因工程菌株RCEF0013-A,从而构建成一个双拷贝的几丁质酶超表达转基因工程菌株和一个蝎毒―几丁质酶双价转基因工程菌株。本实验首先构建了含有筛选标记bar基因和外源几丁质酶基因Bbchit1的载体pbar-GPE1-Bbchit1,通过芽生孢子法将载体质粒转入该野生型出发株RCEF0013,在加入草胺磷(100μg /ml)[1]的SDAY培养基上筛选获得转化子,构建成一个双拷贝的工程菌株RCEF0013-C。再以pbarGPE1-Bbchit1质粒为中间载体,扩增出含有强启动子、终止子及Bbchit1基因的GpdA- Bbchit1-TrpC基因片段,将GpdA- Bbchit1-TrpC基因片段插入pbenGPS3质粒中,构建成一个含有筛选标记ben基因和Bbchit1基因的新质粒pbenGPS3-Bbchit1。将pbenGPS3-Bbchit1质粒用芽生孢子法转入含有外源蝎毒基因AaITd的一价转基因工程菌株RCEF0013-A中,在加入苯菌灵(2μg /ml)[1]的SDAY培养基上筛选获得转化子,构建成一个双价的转基因工程菌株RCEF0013-A-C。几丁质酶酶活测定结果表明,转化子菌株RCEF0013-C在胶体几丁质诱导培养基中酶活最大值高于野生型菌株的4.2倍,从而使该几丁质酶基因在转化的菌株中得到超表达。对马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)进行生物测定的结果显示,超量表达双拷贝的Bbchit1转基因及AaIT和Bbchit1双价转基因均能显著地提高重组菌株的毒力。对马尾松毛虫幼虫进行生物测定的结果表明,转化子RCEF0013-C(4.53×105conidia/ml)的致死中浓度比出发株RCEF0013(2.93×106 conidia/ml)降低5.46倍。致死中量(17.6conidia/ mm2)比出发株(113.9 conidia/ mm2)减少5.47倍,致死中时(5.86天)比出发株(6.58天)缩短0.7天。这表明,几丁质酶基因超表达的球孢白僵菌双拷贝的工程株的毒力有了显著的提高。转化子RCEF0013-A-C(1.60×105conidia/ml)的致死中浓度比出发株RCEF0013(2.93×106 conidia/ml)降低17.31倍。致死中量(6.54conidia/mg)比出发株(113.9 conidia/mg)减少16.41倍,致死中时(4.78天)比出发株(6.58天)缩短1.8天。这表明,几丁质酶基因和蝎毒基因超表达的球孢白僵菌双价工程株的毒力有了很大的提高。转化子RCEF0013-C第1~8天酶活与第2~9天感病死虫数呈极显著正相关(P<0.01),而野生型出发株则不相关(P>0.05)。这些证据表明,几丁质酶基因与毒力的关系是复杂的,在分泌达到一定阈值后与毒力才有明显的相关关系。