【摘 要】
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实验目的:Armadillo repeat containing3（Armc3）是Armadillo/beta-catenin-like repeats（ARM）基因家族成员。ARM基因家族成员在信号转导、发育、肿瘤发生和转移等方面发挥作用。此前研究发现Armc3缺失可能与雄性生殖功能异常有关,但是具体生物学功能与分子机制尚待明晰。基于此,本课题拟通过Armc3基因敲除小鼠模型,探究Armc3基因
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实验目的:Armadillo repeat containing3（Armc3）是Armadillo/beta-catenin-like repeats（ARM）基因家族成员。ARM基因家族成员在信号转导、发育、肿瘤发生和转移等方面发挥作用。此前研究发现Armc3缺失可能与雄性生殖功能异常有关,但是具体生物学功能与分子机制尚待明晰。基于此,本课题拟通过Armc3基因敲除小鼠模型,探究Armc3基因缺失对雄性小鼠生殖功能的影响,初步探索潜在的分子机制。实验方法:1.通过RT-qPCR检测Armc3在雄性小鼠组织中的表达情况。2.繁殖利用CRISPR/Cas9技术构建的Armc3-/-小鼠模型,鉴定基因型;通过western blot验证Armc3基因敲除成功。3.通过HE染色观察Armc3-/-雄性小鼠和对照WT雄性小鼠的组织形态;进行精子计数,分析精子活力,精子HE染色观察精子形态;通过PAS染色对Armc3-/-雄性小鼠和对照WT雄性小鼠睾丸中的生精小管进行分期。4.通过透射电镜观察Armc3-/-雄性小鼠和对照WT雄性小鼠睾丸、附睾组织超微结构的改变。5.PCNA免疫组化、TUNEL实验检测生精小管中生精细胞增殖凋亡情况;SYCP3免疫组化检测生精小管中的精母细胞。6.利用蛋白质质谱技术分析Armc3-/-雄性小鼠与WT对照组睾丸差异表达蛋白。7.为进一步分析Armc3在精母细胞中的生物学功能,利用CRISPR/Cas9技术建立Armc3 KO GC-2精母细胞,并进行RNA-seq分析。实验结果:1.RT-qPCR结果显示Armc3在睾丸组织中高表达,在肺组织中少量表达,在其他组织中几乎不表达。2.western blot结果显示Armc3基因成功敲除。Armc3基因敲除导致雄性小鼠不育。与同窝WT雄性小鼠相比,各器官重量占体重比并无明显差异;附睾精子数减少,精子活力明显降低,精子畸形比例增加;HE染色结果显示Armc3-/-雄性小鼠附睾中精子数量减少,精子头畸形常见,精子鞭毛排列混乱,生精细胞脱落;睾丸中可见死亡生精细胞形成的空泡,精子头畸形,生精细胞成团脱落至管腔;其他组织形态无变化。3.透射电镜观察到Armc3-/-雄性小鼠附睾中的精子顶体溶解、鞭毛结构组装混乱、鞭毛胞质残余。睾丸中各级生精细胞未见明显异常。4.PCNA、TUNEL实验结果显示,与对照组相比,Armc3-/-雄性小鼠生精小管中生精细胞的增殖、凋亡未见明显变化;SYCP3免疫组化结果提示Armc3-/-雄性小鼠生精小管中精母细胞减少。5.Triple TOF5600检测结果显示,Armc3-/-雄性小鼠和对照WT雄性小鼠睾丸相比,差异蛋白包含姐妹染色单体分离、精子顶体相关蛋白、动力蛋白臂重链等相关蛋白。6.Armc3 KO抑制GC-2精母细胞增殖。RNA-seq数据显示,Armc3KO导致GC-2细胞RNA修饰、核糖体生物发生相关通路基因下调,而细胞外基质相关基因上调。实验结论:1.Armc3基因敲除导致雄性小鼠不育,其可能影响精子顶体结构和精子活力。2.Armc3正调控精母细胞增殖,其机制可能与调控细胞RNA修饰、核糖体生物发生有关。
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