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研究背景结直肠癌为全球最常见肿瘤之一。据最新统计,全球结直肠癌的发病率高居各类肿瘤的第三位,为第四大肿瘤死亡的原因[1],同时,我国近年结直肠癌发病率也呈明显增高趋势。因此,迫切需要研究清楚结直肠癌的致癌机制,并积极寻找有效方法抑制结直肠癌的发生和发展。大量的研究表明,Wnt通路的异常在人类癌症尤其是结直肠癌中起着重要的作用[2,3],超过90%的结直肠癌是由Wnt信号通路的突变使β-catenin的降解受抑制而引起的[4]。然而,对与β-catenin是如何在肿瘤细胞中激活Wnt通路的目的基因的目前仍不清楚。我们通过对一组DNA去甲基化酶进行筛选意外地发现TDG(Thymine DNAGlycosylase)能激活Wnt信号通路,同时我们观察到TDG能与β-catenin的共激活因子TCF4及CBP交互作用。TDG能够识别、水解错配的碱基,并与其他修复蛋白共同修复DNA[5],TDG还与多种转录因子作用,参与基因的转录调节[6-10]。最新的研究发现在一个直肠癌患者中存在突变的TDG[11,12]。另外,有研究发现TDG是p53家族的共激活因子,p53直接结合到TDG的启动子后上调控TDG的表达,并进一步抑制肿瘤细胞的生长[13-15],但确切的机制不详。研究目的为研究TDG与肿瘤的发生发展及预后的相关性,本项目将探讨TDG对肿瘤Wnt信号通路的作用及机制,分析TDG在人类结直肠癌中的表达情况,明确TDG在肿瘤中的作用,为肿瘤的诊断和治疗提供新的靶点。实验方法1.通过TOPFlash报告基因系统分析TDG与Wnt信号通路的关系,观察TDG敲除后Wnt的信号变化;RT-PCR检测shRNAs敲除TDG后,Wnt信号通路上的目的基因的表达情况;运用染色体免疫沉淀方法检测TDG是否作用于Wnt信号通路上的因子的启动子区;构建TDG不同结构域表达载体,通过TOPFlash报告基因系统观察TDG不同结构域对Wnt信号通路的作用。2.免疫共沉淀方法分析TDG与TCF4/CBP的相互作用,并进一步分析TDG不同结构域与TCF4/CBP的作用情况;细胞免疫荧光染色分析TDG与TCF4/CBP在细胞中的分布。3.点突变制作N140A及SUMO修饰位点的突变,同时通过TOPFlash报告基因系统及免疫共沉淀方法分析突变后的TDG对Wnt通路的影响;细胞免疫荧光染色分析TDG突变后在细胞中的定位。4.使用Wnt信号通路的小分子抑制物ICG-001作用于HCT116结直肠癌细胞系,分析Wnt信号通路受抑制后TDG的表达情况;构建TDG的启动子报告基因表达载体,观察Wnt信号通路上的成员对TDG启动子的作用。5.用带有TDG shRNAs的病毒感染HCT116、HT29和LS174T结直肠癌细胞,观察TDG敲除后对体外培养的结直肠癌细胞生长的影响;用带有TDG shRNAs病毒感染过的HT29细胞注射到裸鼠两侧背部,每周两次测量肿瘤的大小,共测量三周,观察TDG敲除后对移植瘤的影响。6.收集临床结直肠癌组织样本进行免疫组织化学染色,分析TDG在人类结直肠癌的表达。7.对北美结直肠癌数据库的资料进行统计学分析。运用两个样本t检验分析TDG在正常人群和结直肠癌中的分布;运用单因素方差分析检验TDG的表达与结直肠癌的分期、分级的关系;运用比例风险模型,根据TDG的表达情况,将数据库资料分为TDG高表达组,TDG中表达组及TDG低表达组,用Kaplan-Meier曲线及回归模型分析法分析TDG的表达与结直肠癌病人的存活时间的关系。实验结果1.在TOPFlash报告基因系统中,我们发现TDG能上调Wnt信号强度,TDG被敲除后Wnt信号受到抑制;RT-PCR提示Wnt通路的目的基因Survivin、Axin2和c-myc的转录水平随TDG的转录受抑制而降低,其中TDG与survivin存在明显正相关;染色体免疫沉淀法中,TDG结合到c-myc的启动子区,该区的组蛋白乙酰化水平在TDG被敲除后下降;TDG N端及C端对Wnt信号的影响都较全长TDG弱。2.β-catenin的共同激活因子TCF4和CBP的HAT结构域均与TDG的N末端结合,并定位于细胞核中,实验过程中没有发现β-catenin与TDG直接作用。3.N140A和SUMO结合位点突变后,TDG仍能跟转录复合物的成员TCF4及CBP HAT结构域结合,但TDG上调Wnt信号的效能减弱。同时,我们分析了上述突变后TDG在细胞中的分布情况,发现野生型TDG主要分布在细胞核膜,N140A突变后TDG主要分布在细胞核,但有出核现象;D133A及D133A&E310Q突变后,TDG的分布也出现出核现象,而E310Q突变却未见明显的出核现象。4.用Wnt信号通路的抑制物ICG-001处理HCT116结直肠癌细胞后发现ICG-001抑制TDG的表达;我们也发现在LS174T-KLF4细胞中,强力霉素诱导KLF4过表达后TDG的表达降低;报告基因系统提示KLF4作用于TDG的启动子区,TCF4显性负性突变体(dominant-negative TCF,dnTCF)也结合在TDG的启动子区,并抑制TDG的表达。5.体外培养中的结直肠癌细胞系HCT116、HT29和LS174T在敲除TDG后生长均受到明显的影响;将敲除TDG的HT29细胞注射到裸鼠两侧背部,发现敲除TDG的HT29移植瘤的生长同样受到明显抑制。6.通过抗TDG抗体对人类结直肠癌组织样本的TDG免疫组织化学染色,发现结直肠癌组织中的TDG的表达明显高于癌旁组织和正常组织。7.对北美结直肠癌数据库收集的临床资料进行分析,发现TDG在结直肠癌肿瘤中的表达明显高于正常人群;未发现TDG与结直肠癌的分期有明显的相关性,但是TDG在结直肠癌的分级第三级中表达增高;同时我们发现TDG的表达与结直肠癌病人的生存时间成负相关。TDG的表达越高,结直肠癌病人的生存时间越短。结论本研究证明TDG对Wnt信号通路有明显的调控作用。TDG主要通过与Wnt信号通路上的转录复合物相互作用上调Wnt信号,此调控过程需要TDG的糖苷酶功能及SU]MO化修饰。同时,Wnt信号通路也反馈调控TDG的表达。TDG不仅调控Wnt信号,而且进一步调控在肿瘤生长。进一步的研究发现TDG在人类结直肠癌肿瘤组织中的高表达;TDG的表达与结直肠癌病人预后的存活时间呈负相关,TDG的表达越高,病人存活时间越低。提示,TDG是结直肠癌肿瘤致癌因子,TDG可以作为临床上评估病人预后的指标,并有可能成为结直肠诊断和治疗的新靶点。