一、目的铁沉积与肝纤维化的关系密切,其在肝纤维化的发生、持续及进展中发挥着重要作用。本研究以肝纤维化发生、发展的中心环节一肝星状细胞（HSC）活化为切入点,通过建立铁沉积HSC细胞模型,研究铁沉积于HSC细胞对HSC细胞α-SMA蛋白表达和Ⅰ型胶原、TGF-β₁ mRNA的表达以及对HSC细胞凋亡的影响,开展铁沉积于HSC细胞对肝纤维化的影响及复方肝毒清干预作用的研究。用二甲基亚硝胺（DMN）建立大鼠肝纤维化模型,以大鼠血清铁蛋白、转铁蛋白及肝组织肝铁浓度作为大鼠铁负载的评价指标,并通过普鲁士蓝和α-SMA双染色,对HSC细胞铁沉积进行定位,明确HSC细胞铁沉积与肝纤维化之间的联系;进一步通过研究HSC细胞活化相关因子TGFβ₁ mRNA的表达,初步明确铁沉积于HSC细胞在大鼠肝纤维化中的作用。从组织病理学、细胞学及分子水平开展铁沉积于HSC细胞与肝纤维化的相关性研究,试图阐明铁沉积于HSC细胞促进肝纤维化的发病机理。体内外分别以中药汤剂复方肝毒清对铁沉积HSC细胞模型和DMN诱导的肝纤维化大鼠模型进行干预,试图阐明以扶正利湿解毒为治疗原则的复方肝毒清对铁沉积于HSC细胞促进肝纤维化的影响。二、方法（一）细胞实验:铁沉积于HSC细胞对肝纤维化的影响及复方肝毒清的干预作用1.建立铁沉积HSC细胞模型以HSC-T6细胞为模式细胞系,培养于6孔板,每孔中均置入1.8cm之正方形盖玻片（无菌处理）,将细胞分为铁沉积模型组、铁沉积模型+去铁铵组、正常对照组共3组,每组重复2孔。根据细胞毒性实验,选择25μM的柠檬酸铁胺（FAC）作为实验浓度。待细胞贴壁长满后铁沉积模型组中加入FAC;铁沉积模型+去铁铵组中分别按照摩尔数1:1加入FAC和去铁铵;正常对照组为正常培养的HSC-T6细胞。继续培养24 h后行普鲁士蓝染色。2.铁沉积于HSC细胞对其活化和转归的影响及去铁铵的干预作用HSC-T6细胞分为正常对照组、铁沉积模型组、50μM去铁铵组、25μM去铁铵组。正常对照组为正常培养的HSC-T6细胞,铁沉积模型组为经25μM FAC处理并证实铁沉积的HSC-T6细胞,50μM去铁铵组、25μM去铁铵组为分别经50μM和25μM去铁铵处理的HSC-T6细胞。继续培养24 h后,免疫组化检测α-SMA的表达;定量PCR法检测细胞Ⅰ型胶原、TGF-β₁ mRNA的表达;TUNEL法检测HSC-T6细胞的凋亡;电镜观察HSC-T6细胞超微结构。3.复方肝毒清对铁沉积诱导HSC细胞活化和转归的干预作用HSC-T6细胞分为正常对照组、铁沉积模型组、铁沉积模型+中药组。正常对照组为正常培养的HSC-T6细胞,铁沉积模型组为经25μM FAC处理并证实铁沉积的HSC-T6细胞,铁沉积模型+中药组为复方肝毒清（按细胞毒性实验确定的最大无毒浓度）处理的铁沉积模型组HSC-T6细胞。温育24小时后,免疫组化检测α-SMA的表达;定量PCR法检测HSC-T6细胞TGF-β₁ mRNA的表达;TUNEL法检测HSC-T6细胞的凋亡;电镜观察HSC-T6细胞超微结构。（二）动物实验:铁沉积于HSC细胞在DMN诱导大鼠肝纤维化中的作用及复方肝毒清的干预机理75只SD大鼠随机分为空白对照组（12只）、模型组（15只）、模型+去铁铵组（12只）、模型+秋水仙碱组（12只）、模型+中药复方肝毒清大剂量组（12只）、模型+中药复方肝毒清小剂量组（12只）共6组。铁沉积大鼠肝纤维化模型造模方法为:用生理盐水配制1:100（V/V）的二甲基亚硝胺（DMN）稀释溶液,每周前3天对大鼠进行腹腔注射,剂量为10μL DMN/kg体重,共4周,空白对照组腹腔注射生理盐水。从造模第2周开始,模型+秋水仙碱组按照秋水仙碱0.1mg/kg体重灌胃,1次/日×3周;模型+中药复方大、小剂量组分别以20g/kg、5g/kg体重灌胃,1次/日×3周。模型组及空白对照组均灌胃生理盐水10ml/kg,1次/日×3周。从造模第3周开始,模型+去铁铵组以去铁铵100mg/kg腹腔注射,3次/周×2周。从开始造模到试验结束观察记录动物死亡情况。实验结束时摘眼球取血收集血清,并取左前叶肝脏,部分置于Bouin’s固定液中固定,另取50mg左右肝组织洗净后置于Trizol中并冻存于—70℃待检,剩余部分—70℃冷冻保存。取肝组织左叶分别行HE染色、Masson染色、普鲁士蓝染色、普鲁士蓝和α-SMA双染色作组织病理学观察;电镜观察肝组织超微结构;ELISA法检测大鼠血清铁蛋白、转铁蛋白;采用火焰原子吸收光谱法测定大鼠肝组织肝铁浓度;采用AU400型奥林巴斯全自动生化分析仪测定肝功能、血清铁和血脂;定量PCR法检测TGF-β₁ mRNA的表达。三、结果（一）细胞实验:铁沉积于HSC细胞对肝纤维化的影响及复方肝毒清的干预作用1.建立铁沉积HSC细胞模型经普鲁士蓝染色后,镜下HSC细胞核呈红色,铁沉积模型组细胞可见蓝色铁颗粒沉积于细胞质中,铁沉积模型+去铁铵组细胞质中亦见不同程度蓝色铁颗粒沉积,但较铁沉积模型组明显减少。正常对照组细胞未见铁颗粒沉积。2.铁沉积于HSC细胞对其活化和转归的影响及去铁铵的干预作用免疫组化结果显示,镜下可见正常对照组HSC细胞明显活化,α-SMA大量表达。铁沉积模型组HSC细胞α-SMA亦大量表达。而去铁铵组HSC细胞α-SMA表达较正常对照组和铁沉积模型组明显减少,说明细胞活化受到不同程度抑制。HSC细胞Ⅰ型胶原、TGF-β₁ mRNA表达结果显示,与对照组比较,铁沉积模型组Ⅰ型胶原mRNA表达显著增强（P＜0.01）,而TGF-β₁ mRNA表达无显著差异（P＞0.05）。50μM去铁铵和25μM去铁铵均能下调Ⅰ型胶原、TGF-β₁ mRNA的表达（P＜0.01）,且50μM去铁铵组优于25μM去铁铵组（P＜0.01）。提示去铁治疗能在转录水平抑制Ⅰ型胶原和TGF-β₁的分泌。HSC细胞凋亡的病理结果显示,正常对照组、铁沉积模型组HSC细胞未见或仅见有较少细胞发生凋亡。而去铁铵组HSC细胞则见明显细胞凋亡,凋亡细胞的细胞核呈棕褐色,并可见凋亡小体。电镜结果显示,正常对照组HSC细胞内细胞器结构如线粒体、粗面内质网形态正常。铁沉积模型组出现大批双核细胞,细胞质中线粒体、内质网等细胞器明显减少。去铁铵组HSC细胞发生凋亡,其特点是凋亡细胞形态变小,核染色体堆积,线粒体、内质网等细胞器明显减少,代之以大量空泡。3.复方肝毒清对铁沉积诱导HSC细胞活化和转归的干预作用免疫组化结果显示,铁沉积模型+中药组HSC细胞α-SMA表达较正常对照组和铁沉积模型组明显减少,说明细胞活化受到不同程度抑制。HSC细胞TGF-β₁ mRNA表达结果显示,铁沉积模型+中药组TGF-β₁ mRNA的表达不同程度下调（P＜0.05）,提示中药复方能在转录水平抑制TGF-β₁的分泌。HSC细胞凋亡的病理结果显示,铁沉积模型+中药组HSC细胞可见明显细胞凋亡,凋亡细胞的细胞核呈棕褐色,并可见凋亡小体。电镜结果显示,铁沉积模型+中药组HSC细胞发生凋亡,其特点是凋亡细胞形态变小,核染色体堆积,线粒体、内质网等细胞器明显减少,代之以大量空泡。（二）动物实验:铁沉积于HSC细胞在DMN诱导大鼠肝纤维化中的作用及复方肝毒清的干预机理1.DMN诱导的肝纤维化大鼠血清铁蛋白、转铁蛋白的变化:对大鼠血清铁蛋白、转铁蛋白的检测发现,与对照组比较,模型组血清铁蛋白明显增加（P＜0.05）,模型+去铁铵组血清铁蛋白有所减少,但无统计学意义（P＞0.05）;而与模型组比较,模型+去铁铵组血清铁蛋白明显减少,有统计学意义（P＜0.01）。就转铁蛋白而言,与对照组比较,模型组血清转铁蛋白明显减少（P＜0.01）,模型+去铁铵组血清铁蛋白虽有所减少,但无统计学意义（P＞0.05）:与模型组比较,模型+去铁铵组血清转铁蛋白明显增加,有统计学意义（P=0.01）。结果表明,在铁沉积大鼠模型中,铁含量增加伴随着血清转铁蛋白水平减少。2.DMN诱导的肝纤维化大鼠肝组织肝铁浓度的变化:对大鼠肝组织肝铁浓度的检测发现,与对照组比较,模型组和模型+去铁铵组肝铁浓度明显增加（P＜0.01或P＜0.05）,而与模型组比较,模型+去铁铵组肝铁浓度明显减少（P＜0.05）。3.DMN诱导的肝纤维化大鼠中铁沉积于HSC细胞的组织病理学观察:普鲁士蓝染色结果显示,在模型组,深蓝色铁颗粒主要沿小叶间隔分布,且大部分铁沉积在细胞外;模型+去铁铵组铁颗粒分布较模型组有所减少;正常组肝细胞排列整齐,无铁负载。普鲁士蓝和α-SMA双染色结果显示,与深蓝色铁颗粒分布一致,在坏死区周围,可见大量α-SMA表达阳性的HSC细胞,并且铁颗粒沉积于HSC细胞中。4.去铁治疗和中药复方对DMN诱导的肝纤维化大鼠肝功能、血清铁和血脂的影响:大鼠肝功能、血清铁和血脂的检测结果发现,模型组ALT明显升高（P＜0.01）,同时ALB、G水平显著降低（P＜0.01）。去铁铵、秋水仙碱、中药大小剂量均能降低ALT水平,其中,去铁铵、中药大小剂量组优于秋水仙碱组（P＜0.01或P＜0.05）。就降低AST水平而言,去铁铵和中药小剂量组无显著差异（P＞0.05）,但均优于秋水仙碱组（P＜0.01或P＜0.05）。对于提升ALB水平,中药大剂量组优于去铁铵、秋水仙碱和中药小剂量组（P＜0.01或P＜0.05）。对于G而言,去铁铵、秋水仙碱、中药小剂量均能降低G水平（P＜0.01或P＜0.05）。另外,去铁铵能显著降低血清铁和TG水平（P＜0.01或P＜0.05）,而秋水仙碱和中药大小剂组均不能降低血清铁、TG和CHOL（P＞0.05）。5.去铁治疗和中药复方对DMN诱导的肝纤维化大鼠肝组织病理学的影响:HE染色结果显示,正常对照组肝脏肝板以中央静脉为中心呈条索状,向四周放射样排列,板间有不规则肝窦,分布规律,无胶原纤维存在。模型组肝细胞变性坏死,肝小叶结构破坏,纤维结缔组织增生,假小叶形成。在纤维化组织周围可见出血性坏死,并可见棕褐色颗粒样物质（铁）沉积在肝组织中。模型+去铁铵组、模型+秋水仙碱组、模型+中药大剂量组、模型+中药小剂量组肝细胞变性坏死有所减轻,纤维结缔组织、假小叶形成均不同程度减少。Masson染色结果显示,正常组仅在汇管区和中央静脉壁见少量胶原纤维。模型组大鼠肝组织胶原增生明显,大量较厚的纤维间隔,向肝小叶内伸展,分割包绕肝组织,形成假小叶。模型+去铁铵组、模型+秋水仙碱组、模型+中药大剂量组、模型+中药小剂量组大鼠纤维组织增生程度明显减轻,纤维间隔变窄,着色浅,假小叶较少。电镜下观察,正常对照组大鼠肝细胞呈多面体,肝细胞内细胞器结构如线粒体、粗面内质网形态正常,肝细胞核为圆形或椭圆形,双层膜完整,核孔清楚。铁沉积模型组肝细胞内可见大量脂滴,Disse腔充满大量红细胞,其它肝细胞结构变化包括线粒体空泡化,内质网扩张,呈大囊泡。模型+去铁铵组肝细胞可见脂滴与红细胞明显减少,核染色体堆积,细胞形态变小,线粒体、内质网等细胞器明显减少。模型+秋水仙碱组、模型+中药大剂量组、模型+中药小剂量组脂肪变性和出血较铁沉积模型组不同程度减轻。6.去铁治疗和中药复方对DMN诱导的肝纤维化大鼠肝组织胶原的影响:对铁沉积大鼠肝组织胶原的Ridit分析显示,6组总体平均Ridit值不等或不全相等（χ²=44.2236,v=5,P＜0.01）。进一步进行多样本两两比较的秩和检验（采用Nemenyi法）,结果显示,与对照组比较,模型组、模型+秋水仙碱组、模型+中药小剂量组胶原沉积显著增强（P＜0.05）;但与模型组比较,模型+去铁铵组、模型+中药小剂量组胶原沉积明显减少（P＜0.05）;与模型+去铁铵组比较,模型+秋水仙碱组、模型+中药大剂量组、模型+中药小剂量组胶原沉积无显著差异（P＞0.05）。7.去铁治疗和中药复方对DMN诱导的肝纤维化大鼠肝组织TGF-β₁ mRNA表达的影响:大鼠肝组织TGF-β₁ mRNA的表达结果显示,与对照组比较,模型组及其它各处理组TGF-β₁ mRNA表达显著增强（P＜0.01）;但与模型组比较,模型+去铁铵组、模型+秋水仙碱组、模型+中药小剂量组、模型+中药大剂量组TGF-β₁mRNA表达明显下降（P＜0.01）;对于下调TGF-β₁ mRNA的表达,去铁铵、中药大、小剂量明显优于秋水仙碱（P＜0.01）;其中,模型+中药大剂量组与模型+中药小剂量组相比较,无显著差异（P＞0.05）。四、结论1.细胞实验:外源性铁能够沉积于HSC细胞,诱导HSC细胞活化并促进肝纤维化的持续进展。去铁铵能使HSC细胞活化受到不同程度抑制,甚至诱导其转为静止或发生细胞凋亡。复方肝毒清能在体外发挥抗肝纤维化作用,其机理与其通过抑制TGFβ₁的分泌,抑制HSC细胞活化;诱导HSC细胞转为静止或发生细胞凋亡有关。2.动物实验:在DMN诱导的肝纤维化大鼠中,伴随着胶原的沉积和肝细胞变性坏死,铁不仅沉积于肝组织,而且铁沉积于HSC细胞;用去铁铵治疗后,肝组织铁沉积明显减少,肝组织胶原染色程度和肝细胞变性坏死明显减轻,TGF-β₁ mRNA表达下调,提示肝组织铁沉积是DMN诱导的大鼠肝纤维化形成的促进因素之一,其机制与铁沉积于HSC细胞并促进HSC细胞活化有关。复方肝毒清能保护肝细胞,改善肝功能;在转录水平抑制TGFβ₁的分泌,抑制HSC细胞活化;抑制胶原纤维的增生,从而起到抗肝纤维化作用。