【摘 要】
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甘露聚糖酶可以将甘露聚糖分解,得到甘露寡糖。如果将它和其它糖苷水解酶联合.作用,还可以得到甘露糖。目前,它已广泛地应用于饲料,食品,医药,造纸和脱胶等工业中。本论文从
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甘露聚糖酶可以将甘露聚糖分解,得到甘露寡糖。如果将它和其它糖苷水解酶联合.作用,还可以得到甘露糖。目前,它已广泛地应用于饲料,食品,医药,造纸和脱胶等工业中。本论文从臭豆腐卤液中分离得到了一株短小芽孢杆菌Nsic-2,并发现它能分泌一种在甘露聚糖的代谢过程中起到关键性作用的酶。我们通过简并PCR,基因走读和巢式PCR得到了这个酶基因的全长序列,将其命名为manB。此序列有一段1104bp大小的开放阅读框,编码367个氨基酸。其氨基酸序列与短小芽孢杆菌CCAM080065来源的甘露聚糖酶相似性很高,属于糖苷水解酶家族26。将基因manB克隆到三个大肠杆菌表达质粒pET-28a, pET-32a和pET-42a中,得到了三个重组表达质粒,并分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,成功表达出有活性的甘露聚糖酶,测得的酶活最高可达11021.3U/ml,高于文献报道过的其他芽孢杆菌来源的甘露聚糖酶酶活。粗酶液经亲和层析纯化后,得到了纯酶。纯化后的蛋白经SDS-PAGE分析,在41kDa左右处检测到了单一条带。我们研究了甘露聚糖酶manB的酶学性质,发现其最适反应温度为30V,在30-40℃之间酶活很稳定；最适反应pH为6.0,与其他甘露聚糖酶相比,在pH 6.0-9.0之间具有较高的酶活力和稳定性,使得其在造纸工业中有很大的应用潜力。金属离子Ca2+和化学试剂二硫苏糖醇可以明显提高manB的活力。manB对于中性的蛋白酶(胰蛋白酶和蛋白酶K)的抵抗力较强。又测得其动力学参数Km=35.66mg/ml, Vmax=14.86μmol/(ml·min)。为了可以将甘露聚糖酶应用于食品和饲料工业中,还研究了甘露聚糖酶在食品级安全微生物枯草芽孢杆菌中的表达。将基因manB克隆到两个枯草芽孢杆菌表达质粒pHT43和pBNS2中,得到两个重组表达质粒,并分别转化到枯草芽孢杆菌WB800N和IA751中,成功表达出有活性的甘露聚糖酶,测得的酶活分别为389.3U/ml和7.11U/nl。
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