论文部分内容阅读
目的和意义膀胱癌是我国泌尿生殖系统最常见恶性肿瘤,首次确诊时多为表浅性。目前对表浅性膀胱癌常规治疗为经尿道电切术(TUR)、术后辅以膀胱灌注化疗或免疫治疗。即使如此膀胱癌仍有较高的复发率,因此开发新的膀胱内灌注药物是膀胱癌研究的一个方向。Survivin是肿瘤基因治疗的潜在靶点,而RNA干扰是近年发现的高效基因沉默方法。本研究承接前期实验成果,探讨了靶向Survivin基因的RNA干扰对膀胱癌细胞T24皮下肿瘤生长的影响,以及在原位动物模型中对膀胱癌的治疗作用。方法(1)构建Survivin基因shRNA真核表达载体pRNAT-survivin,转染人膀胱癌细胞T24并获得稳定的单克隆细胞。实时定量PCR检测稳定转染干扰质粒后T24细胞Survivin mRNA变化,将稳定转染干扰质粒的单克隆细胞与未转染的T24细胞分别接种于5只裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况,肿瘤组织行免疫组化检测Survivin蛋白表达。(2)直视下经尿道机械损伤BALB/c裸鼠膀胱粘膜,将人膀胱癌T24细胞经尿道种植于25只裸鼠膀胱,建立荷人膀胱癌原位动物模型。以Gd-DTPA作为膀胱造影剂,每周取5只裸鼠行MR检测肿瘤的生长,MR检查后即取裸鼠膀胱组织标本行HE染色进行病理学检查。(3)同法建立膀胱癌动物模型分为4组,每组6只裸鼠,A组:不予任何处理;B组:膀胱灌注浓度0.5 mg/ml的丝裂霉素;C组:膀胱灌注浓度为150μg/ml RNAi-survivin的干扰质粒;D组:干扰质粒和丝裂霉素交替膀胱灌注;膀胱灌注治疗6次后荷瘤膀胱称重,行病理学检查及免疫组化检测膀胱肿瘤Survivin、Caspase-3表达。结果(1)成功构建靶向Survivin的shRNA真核表达载体pRNAT-survivin,经筛选和挑取单克隆后测得转染细胞的表达率为94.7%,稳定转染重组质粒的T24细胞Survivin mRNA表达下调达92.86%;裸鼠皮下接种肿瘤细胞后,未转染组在20～29天均发展为体积超过2000 mm3的肿瘤,转染组在43天时形成3个体积不超过62.5 mm3肿瘤;免疫组化显示转染组肿瘤Survivin蛋白表达明显降低。(2) 25只裸鼠在种植T24细胞后均形成膀胱肿瘤。种植后7天裸鼠膀胱MR检查无明显变化,l4、21、28天MR检查均可发现膀胱不同程度的充盈缺损,MR图像与肿瘤实际大小吻合。病理检查显示:种植后7天,肿瘤生长于裸鼠膀胱粘膜或肌肉表层;14～28天局限于肌层;35天时侵及浆膜层。(3)测得A、B、C、D 4组膀胱肿瘤重量分别为62.48±5.14 mg、41.58±7.90 mg、38.60±4.44 mg、26.97±6.19 mg,浓度为150μg/ml靶向Survivin的干扰质粒膀胱灌注达到与0.5 mg/ml丝裂霉素相近的抗肿瘤作用(P=0.404),两者交替膀胱灌注较单用丝裂霉素或干扰质粒更有效抑制膀胱肿瘤生长(P<0.05)。免疫组化显示:A组膀胱肿瘤浅层与深层Survivin表达均为强阳性,Caspase-3散在少量表达;C、D组的膀胱肿瘤浅层Survivin表达减弱;B、C、D组膀胱肿瘤浅层呈现Caspase-3高表达。结论(1)靶向Survivin的shRNA持久地抑制了膀胱癌细胞T24裸鼠皮下移植瘤生长;Survivin基因可作为膀胱癌基因治疗的良好靶点。(2)成功建立了裸鼠原位膀胱癌动物模型,肿瘤生长基本模拟了人膀胱癌的发生、发展过程;MR检查可作为对裸鼠膀胱原位肿瘤动态观察的可靠方法。(3)靶向Survivin的干扰质粒膀胱灌注可达到与丝裂霉素相近的效果,两者交替膀胱灌注可明显增加丝裂霉素的抗肿瘤作用。可能机制为阻断膀胱肿瘤Survivin表达引起肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长;因与丝裂霉素作用于不同细胞周期增强了膀胱肿瘤对丝裂霉素的化疗敏感性。综上所述,本研究发现靶向Survivin的RNA干扰对膀胱癌细胞T24裸鼠皮下及原位移植瘤的抑制作用,结合前期体外实验结论,认为Survivin基因可作为膀胱癌基因治疗的良好靶点,但作用机制和临床实施方法有待进一步研究。