论文部分内容阅读
酱油中的主要风味物质大都是由发酵过程中添加的酵母产生,但是在酱油高盐稀态发酵中盐的浓度高达17%,致使酵母的代谢活性明显降低,这严重影响风味物质的形成,导致酱油质量下降。因此,本实验室应用基因组重排技术,以野生型T酵母为出发菌株构建了耐盐的优良酵母菌株T3-5。此外,因为目前对T酵母的基因组序列处于未知状态,而且对于T酵母和T3-5耐盐机制还不清楚。所以本文对T酵母(Torulopsis versatilis)和T3-5的耐盐基因HOG1进行研究,即在基因转录水平、基因的过量表达、DNA序列及蛋白质结构等分子水平上进行多角度的分析及比对,从而为阐明T酵母的耐盐机制奠定良好基础。本文通过半定量PCR(RT-PCR)对T酵母和T3-5在不同盐浓度下耐盐基因HOG1的RNA表达量进行了分析,研究发现,T3-5的HOG1表达量明显高于T酵母；继而对T酵母和T3-5的HOG1进行克隆测序,即分别将其PCR产物插入到测序载体pUC19中,构建质粒pUC19-T和pUC19-T5,测序结果发现T3-5的HOG1的碱基发生了突变；而后将测序结果翻译成氨基酸,并经NCBI比对,整理拼接后进行蛋白质的二级、三级结构预测,分析发现T和T3-5之间有两个明显的氨基酸差异,同时T3-5的蛋白等电点高于T酵母；最后,分别将T酵母和T3-5的HOG1目的基因片段插入到YEp195表达载体中,随后将所构建的质粒YEp195-T和YEp195-T3-5分别转入酿酒酵母实验室菌株W303-1A中,并对所构建的工程菌株进行耐盐度及其他指标分析,研究发现,菌株W-Y-T5的耐盐性强于W-Y-T,同时又都明显强于对照菌株W-Y。通过本文的研究表明：HOG1基因同样是T酵母渗透压调节机制中的关键基因；T3-5的HOG1基因转录水平增强是导致其耐盐性提高的一个重要原因。