目的:受体相互作用蛋白激酶-3(Receptor-interacting protein kinase3,RIPK3)是受体相互作用蛋白家族(Receptor-interacting protein kinases,RIPKs)家族的重要成员,具有蛋白激酶家族特征性的丝/苏氨酸酶活性。RIPK3广泛表达于人体各种组织中,能够在炎症、损伤、感染等体内外刺激因素的作用下经由肿瘤坏死因子-α-RIPK1信号通路活化,其下游信号通路包括诱发线粒体活性氧自由基(Reactive oxygen,ROS)生成、凋亡、细胞程序性坏死(Necroptosis)以及NF-κB的活化。通过调节细胞增殖和死亡,参与到细胞对外界环境的适应过程中。有研究证明,RIPK3在神经系统中发挥着重要的作用,能够调控由TNF-α引起的小鼠海马神经元的损伤。同时抑制RIPK3的活化能够有效减少脑内出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)后小鼠颅内血肿体积、减少血管性神经元损伤、减缓神经元死亡进而改善ICH小鼠模型预后。然而,近年来,对于RIPK3的研究主要集中于揭示其在细胞程序性坏死过程中作用机制,研究目标较为笼统未对具体的组织、系统进行划分并进行深入的研究,特别是RIPK3在神经系统中所发挥的的作用及其作用机制尚需进一步的研究跟探索。方法:1.在SH-SY5Y细胞内稳定过表达RIPK3蛋白构建并扩增携带有过表达RIPK3基因及对照空载质粒,将转染携带过表达RIPK3基因的SH-SY5Y细胞作为实验组,转染空载质粒的SH-SY5Y细胞作为对照组。转染后48 h用激光共聚焦显微镜观察两组细胞中是否表达质粒所携带的绿色荧光蛋白(GFP),通过Western blot检测外源性RIPK3是否在细胞中稳定过表达2.测定MTT实验中12、20、28、36、44 h时间点两组细胞吸光度值并计算得出两组细胞在相应时间点细胞增殖情况是否存在差异,以验证外源性RIPK3在SH-SY5Y细胞中是否具有生物学活性。3.提取两组细胞RNA,对其进行全面的检测,以确保RNA符合实验要求。获得纯化的m RNA,运用转录组测序技术(RNAseq)对两组细胞内m RNA进行测序检测,获得完整的转录组信息。将结果录入Ingenuity Pathway Analysis(IPA)数据库进行分析获得RIPK3下游信号通路及其关键性分子。4.提取两组细胞RNA,逆转录为c DNA,采用微滴式数字化PCR(dd PCR)对RNAseq结果中处于核心位置的基因转录水平改变进行验证。结果:1.转染后两组细胞在激光共聚集显微镜下呈现绿色荧光,细胞内表达质粒所携带的GFP蛋白。Western blot实验提示实验组细胞内源性RIPK3(分子量为56 k Da)正常表达,其表达水平与对照组基本一致。于此同时实验组细胞内稳定表达外源性RIPK3-GFP融合蛋白(分子量为85 k Da)。2.MTT试验中分别在12、20、28、36、44 h时间点对细胞增殖活性进行检测。实验组细胞增殖活性低于对照组(n=5,t分别为6.717、5.094、14.900、11.914、23.903,均P<0.01),提示外源性RIPK3-GFP蛋白对SH-SY5Y细胞增殖具有抑制性作用,在细胞内具有生物学活性。3.RIPK3表达水平上调后,细胞转录组发生了明显改变。两组细胞进行RANseq测序结果表明两组细胞转录组RNA转录具有明显的差异性。将测序结果录入IPA进行数据分析及严格的筛选最终获得了部分转录水平发生明显改变的信号通路。包括:HIF1-α及其相关基因UBC、VHL、TCEB1、VEGFA;ZFP36及其相关基因VEGF、DCP2、BDNF、TNF;m TOR及其相关基因SREBP、S6K、Eif4B、e EF2K、ULK。4.dd PCR结果采用dd PCR检测信号通路中核心信号分子:HIF1-α、ZFP36以及m TOR表达水平的变化情况,对RNAseq结果进行重复性验证。结果提示HIF1-α、ZFP36以及m TOR表达水平的改变趋势与RNAseq结果基本一致。结论:本论文对RIPK3表达水平发生上调后SH-SY5Y细胞内基因转录情况进行的检测及分析,初步确认了RIPK3下游可能存在的效应信号通路,为我们进一步研究RIPK3在神经系统中所发挥的重要作用及其机制确定了方向。