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研究背景肿瘤干细胞(Cancer stem cell,CSC)是指肿瘤组织中的一群具有无限自我更新能力的细胞,是促使肿瘤无限生长的来源。CSC能够抵抗放化疗的杀伤,是肿瘤复发的蓄库和转移的根源。如何有效抑制或清除CSC成为了当今肿瘤领域的研究热点,而诱导并维持CSC多潜能“干性”的分子机制是CSC研究的核心问题。Cdc6(cell division cycle 6)主要功能为起始DNA复制,在肿瘤细胞中高表达且与肿瘤恶性进程相关,而Cdc6的高表达不仅仅是肿瘤旺盛增殖所导致的结果,Cdc6本身就有促进细胞恶性转化的能力。最近研究发现,Cdc6在肿瘤细胞中可作为转录抑制因子抑制抑癌基因INK4/ARF的转录,INK4/ARF能同时编码3个蛋白:p16INK4A、p15INK4B和p14ARF,分别通过pRb和p53通路调控细胞周期。INK4/ARF在人类肿瘤中出现频发的失活,与肿瘤的发生、发展和预后密切相关。而且此基因转录抑制是CSC多潜能“干性”的重要特征,因此Cdc6极有可能通过抑制INK4/ARF参与CSC多潜能“干性”。去甲斑蝥素(Norcantharidin)是我国自主研发的抗肿瘤药物,目前被广泛应用于多种肿瘤的治疗,但其具体的抗肿瘤机制目前仍未完全阐明,本课题组之前研究发现NCTD能降解肿瘤细胞Cdc6蛋白,发挥抗肿瘤活性。研究目的1、通过有限稀释法从建系肿瘤细胞株中筛选获得CSC,并鉴定。2、探究在CSC中,Cdc6蛋白表达情况及其是否参与调控INK4/ARF基因。3、探究去甲斑蝥素(抑制Cdc6)对CSC的影响。研究方法1、CSC筛选:取建系的肿瘤细胞HepG2和UMUC-3,超低吸附培养板中进行单克隆培养,加入无血清培养基(含EGF 20ng/mL、b-FGF 20ng/mL、LIF 20ng/mL、干细胞添加剂B27 20μL/mL和BSA 4μg/mL的DMEM/F12培养基),连续培养2个月以上获得。2、CSC鉴定:利用qPCR、流式细胞术,检测肿瘤干细胞标志物CD133、CD44、NANOG、OCT4、ABCG2;裸鼠体内成瘤实验检测细胞成瘤能力。3、CSC功能学方面检测:MTS实验检测体外细胞增殖及化疗药物的杀伤、EdU掺入实验检测DNA复制、流式细胞术检测细胞周期。4、通过Western blotting和Chromatin binding检测Cdc6蛋白总量及染色质中和非染色质部分的表达。5、通过 Chromatin Immunoprecipitation(ChIP)检测 Cdc6 与 INK4/ARF 基因调控区域的相互作用。6、通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。研究结果1、HepG2和UMUC-3经有限稀释法培养5天可见成球生长的单克隆细胞团,培养20天后取单克隆细胞团继续扩大培养至60天。2、CSC鉴定:流式细胞结果显示,筛选60天的HepG2细胞CD133+比例高达90.4±1.1%,显著高于母代肿瘤细胞(0.5±0.2%),CD44+比例为0.5±0.12%也高于母代肿瘤细胞(0.1±0.04%)。qPCR结果显示CD133、CD44、NANOG、OCT4、ABCG2的mRNA含量均显著高于母代肿瘤细胞。体内成瘤实验显示,接种筛选后的HepG2细胞(1×105个/只)成瘤率为1/5,5×106个/只的成瘤率为3/5,而相对应的母代HepG2均未成瘤。这些结果表明通过本方法筛选出的细胞即为CSC。3、CSC对紫杉醇耐药(PTX)。MTS结果显示:PTX对HepG2-CSC和UMUC-3-CSC 的 IC50 均>>500nM/ml,远大于其对母代 HepG2(60.9±5.7)、UMUC-3(63.0±4.8)。4、CSC为静止休眠期细胞。流式细胞细胞周期检测显示CSC的G0/G1期比例显著提高(HepG2-CSC:70.72±5.2%,UMUC-3-CSC:70.24±4.9);EdU掺入实验显示CSC几乎无DNA复制,表明CSC大多处于静止期。血清释放后静止的CSC重新进入增殖周期,且血清释放四天后,CSC的增殖速率显著高于母代肿瘤细胞。4、静止休眠期CSC中Cdc6的表达。Chromatin binding显示,静止期CSC的Cdc6仍有相当数量的表达,且大多结合于染色质上,与相对应的母代肿瘤细胞相比,非染色质部分的含量显著降低。血清释放进入增殖周期后,非染色质结合的Cdc6逐渐增多,至24小时后恢复到与母代肿瘤细胞相似的水平。5、通过ChIP显示,在CSC中,Cdc6结合在INK4/ARF基因调控区(RDINK4/ARF)(-311～-157)区域,而在-175～-51区域没有结合。6、CSC加入NCTD培养后,HepG2-CSC和UMUC-3-CSC凋亡比例(70.54±0.26%,29.93±1.32%)显著高于对照组(35.00±0.89%,15.11±0.78%)。研究结论1、通过有限稀释法能有效地从建系肿瘤细胞株中筛选获得处于静止休眠期的 CSC。2、静止期CSC中Cdc6仍然在染色质中表达且与RDINK4/ARF结合。3、NCTD可诱导静止期CSC凋亡。